紫外可见分光光度计的结构、工作原理与应用

紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计原理是：分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光谱图再结合其它手段进行定性分析。根据Lambert-Beer定律：A=εbc，（A为吸光度，ε为摩尔吸光系数b为液池厚度，c为溶液浓度）可以对溶液进行定量分析。你可以用紫外可见分光光度计测定定三种农药的波长在某溶液中的最大、最小吸收波长。配制溶液－在光谱检测项下进行－调整检测光谱范围及速度－－扫描光谱图－－吸光度最大处对应波长为最大吸收波长，吸光度最小处对应的波长为最小吸收波长。1.光源灯;2.滤光片;3.球面反射镜;4.入射狭缝;5.保护玻璃;6.平面反射镜;7.准直镜;8.光栅;9.保护玻璃;10.出射狭缝;11.聚光镜;12.试样室;13.光门;14.光电管.分光光度计工作原理:由光源灯(1)发出连续辐射光线,经滤光片(2)和球面反射镜(3)至单色器的入射狭缝(4)聚焦成像,光束通过入射狭缝(4)经平面反射镜(6)到准直镜(7)产生平行光,射至光栅(8)上色散后又以准直镜(7)聚焦在出射狭缝(10)上形成一连续光谱,由出射狭缝选择射出一定波长的单色光,经聚光镜(11)聚光后,通过试样室(12)中的测试溶液部分吸收后,光经光门(13)再照射到光电管(14)上.调整仪器,使透光度为100%,再移动试样架拉手,使同一单色光通过测试溶液后照射到光电管上.如果被测样品有光吸收现象,光量减弱放大器处理,将光能的变化程度通过数字显示器显示出来.可根据需要直接在数字显示器上读取透光度(T),吸光度(A)或浓度(C).基本操作:(1)通电---仪器自检----预热20min;(2)用键设置测试方式:透射比(T),吸光度(A),已知标样浓度方式(C)和已知标样浓度斜率(K)方式;(3)波长选择:用波长调节旋钮设置所需的单色光波长;(4)放样顺序:打开样品室盖,在1~4号放置比色皿槽中,依次放入%T校具(黑体),参比液,样品液1和样品液2.(5)校具(黑体)校0.000:将%T校具(黑体)置入光路,在T方式下按%T键,此时仪器自动校正后显示0.000(6)参比液校100%T或0.000A:将参比液拉入光路中,按0A/100%T键调0A/100%T,此时仪器显示BLA,表示仪器正在自动校正,校正完毕后显示100%T或0.000A后,表示校正完毕,可以进行样品测定.(7)样品测定:将两样品液分别拉入光路中,此时若在T方式下则可依次显示样品的透射比(透光度)若在A方式下,则显示测得的样品吸光度.7200型光栅分光光度计的使用注意事项(1)(1)预热是保证仪器准确稳定的重要步骤.(2)比色皿的清洁程度,直接影响实验结果.因此,特别要将比色皿清洗干净.先用自来水将用过的比色皿反复冲洗,然后用蒸馏水淋洗,倒立于滤纸片上,待干后再收回比色皿盒中.必要时,还要对比色皿进行更精细的处理,如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡,冲洗.(3)比色皿与分光光度计应配套使用,否则会引起较大的实验误差.比色皿不能单个调换1.37200型光栅分光光度计的使用注意事项(2)(4)比色皿内盛液应为其容量的2/3,过少会影响实验结果,过多易在测量过程中外溢,污染仪器.比色皿中试样装入量应为2/3～3/4之间(5)拿放比色皿时,应持其毛面,杜绝接触光路通过的光面.如比色皿外表面有液体,应用绸布拭干,以保证光路通过时不受影响.(6)若待测液浓度过大,应选用短光径的比色皿,一般应使吸光度读数处于0.1～0.8范围内为宜.由于测定空白,标准和待测溶液时使用同样光径的比色皿,故不必考虑因光径变化而引起的影响.UV-754型紫外-可见分光光度计正确使用方法2.1紫外分光光度计法概述(1)2.1.1定义用紫外光源通过分光光度技术对物质进行测定的方法叫作紫外分光光度法.所使用的仪器叫作紫外分光光度计.2.1.2原理因为许多化合物的分子结构中存在共轭双键,在200～400nm的紫外光区具有吸收光的特性,所以无需进行显色反应便能直接测定.2.1.3应用常用于对蛋白质和核酸进行定性,定量测定.蛋白质分子中所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基在波长280nm处具有最大吸收峰.故常用波长280nm处的吸光度测定蛋白质的浓度.2.1.4特点(1)组成核酸的碱基也含有共轭双键,其最大吸收峰的波长在260nm处.但在280nm处也有一定的光吸收,对蛋白质的测定有一定的干扰作用.若分别测定280nm和260nm处的吸光度,可通过经验公式消除核酸对蛋白质测定的影响.(2)可对微量蛋白质(1～10g/L)不需显色,进行直接定量测定.因此操作简便,而且可回收样品.此外,盐类在280nm处无光吸收,少量盐类也不会影响测定结果.(3)紫外分光光度法完全符合Lambert-Beer定律的基本原理.在其它条件保持一致的情况下,被测溶液的吸光度与被测溶液的浓度成正比.2.2UV-754型分光光度计的结构和工作原理2.2.1仪器结构由光源(钨灯或氚灯),单色器,试样室,接受器(光电管),微电流放大器,A/C转换器,打印机,键盘和显示器等部件组成.微处理机(CPU)通过输入,输出口(I/O)对微电流放大器,显示器和打印机等部件进行控制,实现仪器的整体功能.2.2.2工作原理UV-754型紫外-可见分光光度计光学系统1.氚灯;2.钨灯;3.滤光镜;4.聚光镜;5.入射狭缝;6.平面;7.准直镜;8.光栅;9.出射狭缝;10.聚光镜;11.试样室;12.光门;13.光电管2.2.2工作原理由光源氚灯或钨灯(1或2)发出连续辐射光线经滤光镜(3)和聚光镜(4)至单色器入射狭缝(5)处聚焦成像,再经平面反射镜(6)反射至准直镜(7)产生平行光射至光栅(8)在光栅上色散后又经准直镜(7)聚焦在出射狭缝(9)上成一连续光谱,经出射狭缝射出的光在聚光镜(10)聚光后分别通过试样室(11)中的空白溶液(或对照溶液),标准溶液或样品溶液,被部分吸收后光经光门(12)再照射到光电管(13)上.被光电管接收的光信号再被转换成电信号,后者通过输入,输出口(I/O).进入微处理机进行调零,变换对数,浓度计算以及打印数据等处理,将检测结果通过显示器和打印系统显示出来.2.3UV-754型分光光度计使用方法(外型)2.3.1UV-754型紫外可见分光光度计1.试样架拉手;2.键盘部分;3.数据打印;4.波长刻度盘;5.波长手轮;6.电源汗关;7.氚灯触发按钮;8.光源室.2.3UV-754型分光光度计使用方法(键盘)UV-754型紫外-可见分光光度计键盘详细内容说明如下:2.3UV-754型分光光度计使用方法(键盘内容1)①功能键:F1～F8,暂无功能,备扩展使用.②T键:具有三种透光度状态调节功能.③A/C键:吸光度/浓度转换键,按此键可分别表示吸光度0～3A,吸光度0～0.lA,吸光度0～0.1A和浓度四种状态.④送入键:只在A/C键处于浓度状态时才起作用.⑤打印键:手动方式时有效,每按一次,便打印一次数据.⑥控制键:在分别使用设定+,设定一,倍率,显示方式和打印方式各键时,需与控制键分别联合使用才起作用.⑦设定+键:在A/C键处于浓度状态时才能设定标准浓度值,斜率K值或斜率B值等数据.其功能是将设定数值增加.2.3UV-754型分光光度计使用方法(键盘内容2)⑧设定-键:是使设定数值减小,操作与设定+键类同.⑨倍率键:用来设定标准溶液浓度的放大倍数.有1,0.1和0.01三档,与控制键同时按下,倍率便发生相应的变化.⑩显示方式键:可表示积分,浓度和样品号三种状态.(11)打印方式键:存在自动(每移动一次试样架,仪器自动打印一次数据),方式1(手动方式,每按一次此键,仪器打印一次数据)和方式2(每分钟定时打印一次数据)三种状态.每与控制键同时按一次此键便改变一个状态.(12)送纸键:每按一次此键,仪器移动一次打印纸.(13)TAC:数字显示器显示测定结果或输入的数据.2.3.2UV-754型紫外可见分光光度计使用方法(1)(1)测试准备①将盛有空白或对照溶液的比色皿处于试样室光路位置;②选择波长旋动波长手轮选定所需波长;③确定光源波长在200～290nm时,选择氚灯为光源;波长在290～360nm时,同时以氚灯和钨灯为光源;波长在360～850nm时,选择钨灯为光源;若使用氚灯,需按氚灯触发按钮启动;④仪器自检显示器显示754后,数字显示出现100.0,表明仪器通过自检程序,此时仪器进入0～100%,连续和自动状态(打印系统处于自动打印状态)⑤仪器预热30min后方可进行测试.2.3.2UV-754型紫外可见分光光度计使用方法测试过程①数字显示透光度100.0(或吸光度0.00)2～3s后,将盛有标准溶液的比色皿移至光路,打印系统便自动打印出所得数据;②将盛有样品溶液的比色皿移至光路,打印系统即自动打印出该样品的数据.待第一个样品数据打印完毕后,将第二个样品置于试样室光路………,若有多个样品,操作以此类推。