花药培养-(1)

植物组织培养项目六草莓花药培养江苏农林职业技术学院泉州师范学院生物主讲：蔡建秀职称：教授邮箱：[e-mail]项目六草莓花药培养泉州师范学院生物教学目标工作任务实践操作问题探究知识拓展作业教学内容泉州师范学院生物教学终极目标会草莓花药培养和脱毒苗快速繁殖会采集合适的草莓花蕾做为外植体消毒灭菌能剥取花药诱导愈伤组织并分化小苗、继代增殖能对花药培养试管苗染色体观察会进行试管苗驯化、移栽促成目标教学目标泉州师范学院生物草莓（FragariaananassaDuch）是蔷薇科草莓属多年生草本植物，果实鲜艳美丽、芳香浓郁、柔软多汁。且富含糖、蛋白质、磷、钙、铁及大量维生素和有机酸。除鲜食外，还可以加工成果浆、果汁、果酒及各种冷饮和速冻食品，深受广大消费者欢迎。项目介绍泉州师范学院生物泉州师范学院生物花蕾表面消毒、花药培养任务3对向日葵下胚轴和子叶的原生质游离任务1诱导试管苗、鉴定并增殖培养任务4试管苗移栽和管理任务5配制草莓花药培养的培养基任务2工作任务泉州师范学院生物任务1采集草莓花蕾、检查花粉的发育时期一、检查花粉的发育时期（材料选择）单核靠边期的花药。方法：从田间采集花蕾数个，从每花蕾1～2枚花药于载玻片上，加醋酸洋红1～2滴，用玻棒或镊子将花药压碎，剔除碎片，加盖盖玻片镜检（压片染色法）。观察几个视野，若多数花粉只有一个核并被挤向一侧，即为单核靠边期，表明此时花药适合作外植体。泉州师范学院生物通常花粉单核靠边期的草莓花蕾形态是：未开放，花萼略长于花冠或花冠刚露白，花冠白色或淡绿色且不松动，花药微黄而充实。泉州师范学院生物（二）材料预处理将从田间采集的花蕾，用湿纱布包好放塑料袋中，扎好袋口，置4℃左右冷藏箱中放置24～48小时。泉州师范学院生物配制草莓花药培养的培养基。任务2愈伤组织诱导：丰香、明宝B5或MS+BA2.0+KT2.0+IAA4.0分化培养：MS+BA2.0+ZT2.0+NAA0.2诱导生根：1/2MS+NAA0.1泉州师范学院生物花蕾表面消毒、花药培养任务3材料消毒：将接种材料用自来水洗干净20min，用无菌纸轻轻擦干。然后将材料放入已消毒过的广口瓶内，加入70%酒精浸润30s，倒去酒精，再倒入0.1%升汞消毒8min，倒去消毒液后用无菌水冲洗4次。接种：用消过毒的镊子或接种环将花药接种于愈伤诱导培养基上。接种密度宜高。泉州师范学院生物接种后将材料放置培养室内进行培养，温度为25℃，光强1000～3000lx，每日光照12小时。培养15～20d后，花药开始产生愈伤组织，待愈伤组织长至2～4mm时，转入芽分化培养基（MS+6BA0.5mg/L+KT0.5mg/L）。泉州师范学院生物诱导试管苗、鉴定并进行增殖培养任务4草莓花药培养自然加倍频率很高，尤其是继代培养的材料，因而可不进行人工加倍处理。泉州师范学院生物将高2～3cm，根系发达的小植株移入温室，打开瓶盖炼苗3d。然后洗去培养基，即可移栽。试管苗驯化和移栽任务5疏松通气、适宜的保水性、清洁卫生是组培苗对基质的基本要求。泉州师范学院生物泉州师范学院生物试管苗移栽及环境调控任务6幼苗出瓶操作过程要小心仔细，可在容器中加适量水后，用玻璃棒轻轻搅动后倒出，再用镊子夹取，取出的幼苗用水将根部的琼脂等冲洗干净，移栽至苗床。泉州师范学院生物泉州师范学院生物泉州师范学院生物外植体选准备诱导花粉脱分化、分裂花粉植株鉴定花药培养技术驯化和移栽分化、壮苗培养完整植株形成实践操作泉州师范学院生物目的：诱导产生单倍体植株。什么是花药花粉培养？花粉和花药的培养(pollenandantherculture)是指将花粉发育至一定阶段的花药接种在人工培养基上，改变其正常发育和机能，以形成花粉胚或愈伤组织，不经受精而发生细胞分裂，进而由单个花粉粒分化成完整单倍体植株的技术。问题探究泉州师范学院生物花粉粒（也称小孢子）是由花粉母细胞经减数分裂形成。它的染色体数目为体细胞的一半，为单倍体细胞。雄蕊结构：花的雄性器官。包括花丝、花药两部分。其中花药部分由药隔（2n）和花粉粒(1n)组成。泉州师范学院生物•Anther—花粉囊style—花柱•Pollen—花粉stigma—柱头•Filament–花丝eggcell—卵细胞•Embryosac–胚囊petal—花瓣•ovary—子房secundary-•Receptacle—花托sepal—萼片•Embryosacnucleus—胚囊核staminode—退化雄蕊•Germinatingpollen–发芽的花粉ovule—胚珠Anther—花粉囊style—花柱Pollen—花粉Filament–花丝eggcell—卵细胞Embryosac–胚囊petal—花瓣ovary—子房stigma—柱头secundary-Receptacle—花托sepal—萼片Embryosacnucleus—胚囊核staminode—退化雄蕊Germinatingpollen–发芽的花粉ovule—胚珠泉州师范学院生物泉州师范学院生物7天14天213040后曼陀罗的花药培养泉州师范学院生物什么是单倍体植株？什么是单倍体植株？单倍体细胞植物进行有丝分裂时，要进行一种特殊的细胞分裂，即减数分裂。减数分裂后形成的雌、雄配子，其染色体数目为体细胞的一半。将这种具有单套染色体的细胞称为单倍体细胞。单倍体植物(haplobiont)单倍体细胞在人工离体条件下培养，使其单性发育成植物体。这种具有单套染色体的植物称为单倍体植物。泉州师范学院生物花粉是植物的生殖器官，花粉细胞是通过减数分裂而来，因此，花粉细胞内只含有正常植株染色体组数的一半。几个染色体组就是几倍体，如：八倍体单倍体四倍体六倍体单倍体三倍体四倍体单倍体二倍体二倍体单倍体一倍体1、单倍体内含有的染色体组数同配子体一样。2、单倍体是一个相对的概念，是相对正常植株而言的。3、单倍体不一定就是一倍体，它可以是二倍体、三倍体或更高倍体。.单倍体概念的理解单倍体泉州师范学院生物泉州师范学院生物为什么多数植物采用单核期花粉培养容易成功？（一）花粉发育时期：1、适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)选择合适的花粉发育时期是提高花粉植株诱导成功率的重要因素，并非任何时期的花粉都能诱导出花粉植株，只有花粉发育到一定的时期，才对离体培养敏感，对大多数植物而言，适宜的花粉时期是单核期，尤其是单核中、晚期。泉州师范学院生物雄配子体的发育营养细胞生殖细胞精子小孢子的发育时期单核期：单核早期，单核晚期；双核期：双核早期，双核晚期；三核期：三核型花粉植物。泉州师范学院生物小孢子不同发育时期对胚状体和愈伤组织诱导率的影响愈伤组织诱导率：葡萄为例，四分体期为15％，单核期为1％，双核期为0。梨四分孢子期为26.3％，单核－双核期为40％。泉州师范学院生物不同植物种类，诱导愈伤组织和胚状体发生，均有适宜的小孢子发育时期泉州师范学院生物（1）小孢子发育的第三期（小孢子经二次有丝分裂形成成熟花粉）的初期是胚胎形成的临界期。离体培养时，若小孢子的发育期超越这一时期胚状体就不能形成。Niesch(1968)提出，小孢子的双核期，淀粉逐渐积累形成，小孢子就不能再生成植物体。（2）小孢子发育的过程中，花药内源激素的平衡不断改变，随着花粉的成熟，激素平衡变得不适合小孢子的脱分化；或者随着花粉成熟，花粉花粉脱分化必备的物质消耗殆尽，因此，小孢子就不能再生成植物体。原因泉州师范学院生物培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进行细胞学花粉发育时期的镜检。花粉发育时期的检测（1）压片染色法A、醋酸洋红：100ml，45%醋酸水溶液加入250ml烧杯，酒精灯上加热到沸后，慢慢加入2g洋红粉末，再加热10分钟，冷却后加入数滴2％的铁明矾溶液（2g硫酸铁钾或硫酸铁铵加水至100ml），暗红色即可，滤纸过滤入棕色瓶中，置冰箱保存。B、碘－碘化钾：1g碘、2g碘化钾加水稀释至100ml。（2）压片染色法与花器官形态特征结合法花粉单核晚期的烟草花蕾花萼与花冠等长Differentflowerstagesasusedinantherculture.Stage2istheoptimumstageofdevelopmentforuseintobaccoantherculture泉州师范学院生物花粉植株的形态发生方式？1、器官发生型花粉-----多细胞花粉粒----细胞团（愈伤组织）-----继代培养-----单倍体植株。2、胚状体发生型花粉-----多细胞花粉粒----进一步培养----胚壮体-----释放-----植物体。泉州师范学院生物花粉培养过程花粉培养从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍体植株的技术。特点:它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织的干扰，可以获得大量的花粉植株。花粉的分离与纯化：分离法：自然散落法、挤压法、机械游离法（磁力搅拌）纯化：用不同孔径的无菌筛子除杂。茄子用270目screen泉州师范学院生物微室培养平培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形1.成花粉胚状体，最终分化为植株。2.液体培养:悬浮培养，通气性差。3.双层培养：上-液体+下-固体4.看护培养：花粉-滤纸-固体培养基5.微室培养：6.条件培养：在花药培养基中加入失活的花药提取物。花粉培养的方式：泉州师范学院生物基本培养基植物种类不同对培养基的要求不同。如：值得一提的是培养基中高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。铁对花粉胚发育很重要。培养基泉州师范学院生物植物激素的种类和浓度必须结合植物种类和器官发生方式来考虑细胞分裂素和CM促进花粉分化成胚状体，生长素类尤其是2,4-D促进愈伤组织形成，但2,4-D抑制愈伤组织分化成胚状体。泉州师范学院生物分化培养：根据培养目的，调节植物激素分化培养：降auxin,提cytokinin--有利于芽的形成壮苗培养：同时下降，有利于胚状体的正常生长。泉州师范学院生物花药离体培养中维持培养基渗透压主要依赖于糖，启动小孢子细胞脱分化对糖的要求，单子叶植物比双子叶植物高。石刁柏花药培养中，对多细胞花粉粒的诱导效果3w8w蔗糖种类和浓度的筛选泉州师范学院生物添加物CM、LH、CH玉米汁、马铃薯汁、酵母提取液、氨基酸等对提高花粉愈伤组织和胚状体诱导率、促进其生长有良好效果。活性炭能促进胚状体发育，提高花粉植株产量。主要是吸附培养基中抑制生长的有害物质。泉州师范学院生物1)花药培养形成单倍体植株。但花药中的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。2）经染色体组型分析，花药培养中发现有非单倍体植株的存在。3）激素对倍性变化有很大影响。花粉植株的倍性诱导单倍体植株的倍性通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。愈伤组织继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。泉州师范学院生物单倍体的鉴定方法鉴定花药和花粉植株染色体倍性的方法有：1.形态鉴定2.结实性鉴定3.染色体数目鉴定4.遗传标记鉴定。泉州师范学院生物单倍体植株的染色体加倍单倍体植株染色体的加倍方法：1.自然加倍2.人工加倍3.从愈伤组织再生草莓泉州师范学院生物1）人工诱导染色体加倍常用化学诱导方法，有秋水仙素、富民农、对二氯苯、8-羟基喹啉等。秋水仙素是由地中海生长的一种百合科植物秋水仙的种子和球茎提取出来的物质。能溶于水、酒精，可阻止细胞有丝分裂时纺锤丝的形成。（1）小苗浸泡加倍（2）顶芽或腋芽处理加倍（3）培养基加倍泉州师范学院生物单倍体在植物育种中的应用1、单倍体育种的概念指将具有单套染色体的单倍体植物，加倍---纯合二倍体---选出具有优良性状的个体---繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体---育种的原始材料，称之为---单倍体育种相关阅读泉州师范学院生物2、单倍体育种的优越性①控制杂种分离，短育种年限。加速F1代杂合体的纯化。②提高常规育种的效率③有利于隐性性状的选择④快速获得自交系的超雄株⑤其他：如提纯复壮泉州师范学院生物控制杂种分离，短育种年限，加速F1代杂合体的纯化泉州师范学院生