实时荧光定量pcr原理及引物设计

逆转录-实时荧光定量PCR（RT-）qRT-PCR（RT-）qRT-PCR（Reversetranscription）quantitativerealtimePCRRT-PCRReversetranscription-PCRReal-timePCR样品处理RNA提取及逆转录qPCR数据分析样品处理细菌样品收集1-5*109细菌，置于液氮研磨，加入1mLTrizon，混匀，高温（55℃）细胞样品收集1-5*107细胞，加入1mLTrizol，混匀，进行RNA提取或者放置于-80℃冰箱动物样品取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5mL离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆。RNA提取及反转录•将处理好的样品置于室温，静置5min•加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置5min•4℃离心，12000g×15min，取上清•加入等体积异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min•4℃离心，12000g×10min，弃上清•加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清•晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。RNA提取及逆转录•注意事项样品量和Trizol的加入量一定要按比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。实验过程必须严格防止RNase的污染。DNase（RNase-free）RRI（RecombinationRNaseInhibitor）RNA提取及逆转录•RNA质量检测（完整性与纯度）RNA提取及逆转录•反转录注意事项RTPrimer的选择OligodT，随机引物，基因特异性引物gDNA污染RNA提取及逆转录❌qRT-PCR（实时荧光定量PCR）化学原理数学原理标记方法定量分析方法与常规PCR技术比较常规PCR对扩增终产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测。qRT-PCR的化学原理qRT-PCR的化学原理•起点定量：起始DNA量是样本中原来的DNA量，更有意义，重现性好，误差小。•终点定量：终点DNA的量是经过PCR放大的量，存在部分“失真”，并非研究所期望的数据，误差大。qRT-PCR的化学原理•典型的PCR扩增四个阶段qRT-PCR的化学原理•三个概念基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。荧光域值（threshold）的设定：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。qRT-PCR的化学原理•三个概念Ct值：C(Cycle)，t（threshold）表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。qRT-PCR的数学原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)log(1+Ex)*Ct=-logX0+logM(4)Ct=-logX0+logM(5)log(1+Ex)Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量qRT-PCR的数学原理qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记•SYBRGreenI•EthidiumBromide特异性荧光标记•Taqman探针•TaqmanMGB探针•分子信标qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记•SYBRGreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的原料。qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记•SYBRGreenI作用原理qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记•SYBRGreenI标记注意事项•SYBRGreenI与任何dsDNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或者引物二聚体的生成，也将同时被检测，从而导致检测结果不准确。•设计合适引物，防止非特异性扩增。•反应结束后必须做熔解曲线分析。qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记•熔解曲线•对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记•熔解曲线qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记•优点(1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA(2).使用方便-----不必设计复杂探针(3).非常灵敏(4).可做熔解曲线分析(5).便宜•缺点(1).对引物特异性要求较高(2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出;需要不断的优化反应体系,降低非特异性扩增.qRT-PCR的标记方法特异性荧光标记•Taqman探针法•TaqMan探针的特性：(1).5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等(2).3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)(3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光(4).Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针与目标序列互补qRT-PCR的标记方法特异性荧光标记•Taqman探针法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光qRT-PCR的标记方法特异性荧光标记•Taqman探针的设计原则qRT-PCR的标记方法特异性荧光标记•Taqman探针法•优点(1).极高的特异性和准确性：由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针序列的特异性，从两个方面保证了所扩增基因的特异性。(2).良好的重复性•缺点(1).目前合成价格较贵.(2).不能做熔解曲线分析.qRT-PCR的定量分析方法绝对定量（Absolute；Howmany？）相对定量（Relative；Howmuch？）qRT-PCR的定量分析方法绝对定量典型应用领域:特定物种鉴定(e.g.bacteria,virus)特定核酸样本检测(e.g.oncologyresearch)检测病原体载量(e.g.legionella,anthrax)筛选抗生素抗性基因(e.g.MRSA,VRE)水质监测…相对定量典型应用领域:mRNA表达水平的检测(e.g.细胞因子,肿瘤)基因定量(e.g.染色体缺失)研究疾病的微小残留病灶(MRD)GMO检测…qRT-PCR的定量分析方法绝对定量分析方法•绝对定量一般通过标准曲线来确定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。•绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。qRT-PCR的定量分析方法绝对定量分析方法•标准品的制备•严格意义上的操作要求将PCR产物切胶后进行胶回收，并进行质粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠杆菌中增值后提取质粒，并用分光光度计测定含有PCR产物的质粒的OD值，借此来确定质粒的摩尔量，将已知摩尔量的质粒做5倍或10倍的连续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确测定样品中目的基因模板量的定量基础。•现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的PCR产物的摩尔量，然后梯度稀释PCR产物，以此来作为标准品。qRT-PCR的定量分析方法绝对定量分析方法•标准品拷贝数计算标准曲线的绘制未知样品的绝对定量qRT-PCR的定量分析方法相对定量分析方法•绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用，但在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。如X基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了，这时只需要用相对定量的方法就可以得到结果，而不需要对标准品进行定量来确定浓度。由于系统误差的原因，不同的样品很难获得相同量的RNA，这时就有必要引入管家基因来对所有样品进行归一化处理(RNA量校正)，然后再对不同样品之间的目的基因表达量进行比较。qRT-PCR的定量分析方法相对定量分析方法•内参基因的作用：利用内参基因(=内源性对照)对样本间的差异进行归一化处理•内参基因可以修正：样品起始量的差别样品中核酸回收率的差别样品中可能的RNA降解不同样品中核酸质量的差别加样差qRT-PCR的定量分析方法相对定量分析方法•理想的内参基因表达水平在所有样品中是持续、稳定的：正常组织vs.肿瘤组织表达水平不受实验条件变化的影响：处理样本vs.未处理的样本•看家基因(Housekeepinggenes)：编码有基础细胞功能的蛋白质ß-actinmultigenefamily;20genes;1activelocus:hormonesoftyroidgland20pseudogenes:stomachtumorg-actinmultigenefamily;pseudogenesGAPDHmultigenefamily;10-30genes;200inmouse:lung,pancreatic,coloncancermostlypseudogenes:insulin,EGF5.8S,18S,28SRNApseudogenesß2-microglobulinnopseudogenes:Non-HodgkinlymhomaabnormalexpressionintumorsG6PDHnopseudogenes:kidney,stomachtumor:hormones,oxidantstress,growthfactorsPBGDnopseudogenesaldolasepseudogenesHPRTpseudogenesU3,U8,...Pseudogenesornithin:tumorsdecarboxylase...GeneGenomicstructure/pseudogenesRegulatione.g.qRT-PCR的定量分析方法相对定量分析方法双标准曲线法比较Ct法qRT-PCR的定量分析方法相对定量分析方法双标准曲线法所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各生理阶段的目的基因的量和内参基因的量相除，得出一个比值；最后再将不同生理阶段所得的比值相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化。qRT-PCR的定量分析方法相对定量分析方法双标准曲线法优点：思路直观条理清晰最大限度的避免了实验的误差缺点：每次都需要做标准曲线，适合样品量比较多但待测基因量少的实验qRT-PCR的定量分析方法相对定量分析方法比较Ct法此法是经定量的数学原理推导而来该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用此法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的