第三章-基因工程载体

DNA重组技术的基本工具基因的剪刀（分子手术刀）——限制性核酸内切酶基因的针线（分子缝合针）——DNA连接酶基因的运输工具（分子运输车）——载体第三章基因工程载体第一节克隆载体第二节表达载体第三节其它特殊用途载体本章重点掌握的内容1.掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、α-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。2.克隆载体应具备的条件。3.质粒的基本性质。4.标记基因的分类及其作用。5.原核表达载体的表达元件，有哪几种表达方式。基因工程流程图遗传物质+载体重组的DNA分子引入细胞或生物体内复制与表达稳定地遗传给下代1）独立的一个基因或DNA片段，不能自我复制，一般不可以进入受体细胞的；2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。基因工程载体（vector）：能够把外源DNA片段带入受体细胞并进行稳定遗传的DNA或RNA分子。载体的概念RecombinantvectorTransformationofbacterialhostcellCellpropagation载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的要求A、复制起点：能在受体中复制；B、筛选标记；C、限制性内切酶切割位点；D、外源基因的表达：启动子。E、载体的大小：原则上要求载体越小越好；F、适当的拷贝数；G、载体的安全性：质粒不能随便转移;载体的分类按功能分类克隆载体克隆一个基因或DNA片断表达载体用于一个基因的蛋白表达整合载体把一个基因插入到染色体组中按来源分类质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体第一节克隆载体质粒载体噬菌体载体噬菌体-质粒杂合载体人工染色体一、质粒载体1.质粒的概念质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可自我复制和表达。并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等）。分子量在1-200kb之间。大肠杆菌的质粒一、质粒载体2.质粒的空间构型①共价闭合环状DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）一、质粒载体②开环DNA（opencircular，ocDNA）一条链上有一至数个缺口。③线形DNA（linear，LDNA）一、质粒载体同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：SCDNA最快、LDNA次之、OCDNA最慢。SCOCL3.质粒的基本特性质粒的自主复制性质粒的不相容性质粒的可转移性携带特殊的遗传标记一、质粒载体一、质粒载体a.质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringentplasmid）(拷贝数少，为1-5个)和松弛型复制控制的质粒（relaxed）(拷贝数多，可达10-200个拷贝)因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变的pMB1500～700pSC101及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～20一、质粒载体b.质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容一、质粒载体c.质粒的可转移性接合型质粒(含tra基因)能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求非接合型质粒(不含tra基因)不能在天然条件下独立地发生接合作用。用于构建克隆载体的质粒一般是非接合型质粒。一、质粒载体TraproteinfromconjugativeplasmidbomsiteMobgenemobmRNAMobproteinrecipientcellhelperplasmid部分质粒虽不含tra基因，但含bom位点，当宿主细胞内同时存在含mob基因的辅助质粒时，mob基因的产物可打开非接合质粒的bom位点(oriT位点)，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。质粒的可转移性一、质粒载体d.携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，如：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物标记基因的作用1.指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子2.指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞一、质粒载体标记基因的种类1.抗性标记基因（可直接用于选择转化子）a.抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr，Neorb.重金属抗性基因:Cur，Znr，Cdr2.营养缺陷标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如LEU2，HIS4等。3.生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如LacZ4.报告基因氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光素酶基因（luc）、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）一、质粒载体常用的遗传标记基因β-半乳糖苷酶基因（lacZα和lacZβ）β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。荧光素酶基因荧光素酶是由萤火虫产生的可催化荧光素氧化的酶，并产生荧光。一、质粒载体α-互补(α-complementation)蓝白斑筛选一、质粒载体互补显色反应——蓝白斑筛选pBR322plasmid作者或实验室名称F.Bolivar,R.L.Rodriguez质粒的编号一、质粒载体4.质粒载体的命名一、质粒载体5.质粒载体构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因AmprA、删除不必要的DNA区域:尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。B、减少限制性酶切点:缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。C、加入易于识别的选择标记：通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。D、安全性能改造：质粒载体不能在细菌之间随便转移。E、改造或加入基因表达的调控序列：启动子。质粒的改造一、质粒载体6.常用质粒载体pBR322BamHISalIHindIIIPstIScaIAmprori(4.36kb)复制起点遗传标记基因克隆位点克隆位点在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。TCr（1）pBR322一、质粒载体含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。含有大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列，即lacZ’基因。在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的功能。（2）pUC系列质粒载体在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体(转化载体后，阳性克隆在有选择压力的培养基上能正常生长)，其组成如下：无质粒的受体菌-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；无抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养质粒pUC转化的受体菌-半乳糖苷酶的缺失被载体产物互补，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养pUC+外源DNA插入的质粒转化的受体菌载体产物失活，不能互补-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养???无菌斑生长有蓝色菌斑生长有白色菌斑生长一、质粒载体（3）穿梭质粒载体(shuttlevector)：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌动物细胞穿梭载体Yeast复制起点E.coli复制起点E.coli选择标记Yeast选择标记MCS一、质粒载体TA克隆载体——PCR产物克隆载体用Taq酶的PCR产物3’端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5’端突出的T，可与Taq酶的PCR产物间连接，即TA克隆。构建方法：如：pMD18-T，pGEM-T载体的线性化载体末端补平载体末端加T二、噬菌体载体噬菌体（Bacteriophage）它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA(线性)，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。二、噬菌体载体噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。能被开发成为基因工程的有用载体的原因：1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。噬菌体的生活周期1.溶菌周期：烈性噬菌体（virulentphage)感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。2.溶源周期：温和噬菌体（temperatephage)感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中，成为它的一个组成部分。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。二、噬菌体载体二、噬菌体载体1.λ噬菌体载体：双链DNA温和噬菌体DNA大小约为50kb粘性末端：12bp的互补单链当λ噬菌体进入寄主细胞内后,其粘性末端能通过碱基互补作用,形成环状DNA分子。粘性末端形成的双链区域称为cos位点,它是包装蛋白的识别位点,λ噬菌体的包装与DNA特性和其它序列无关,但对包装的DNA大小有要求,包装范围大约在36kb-51kb。二、噬菌体载体λ噬菌体作为构建载体材料的依据：λ噬菌体是一种温和噬菌体；能承载比较大的外源DNA片段；在λ噬菌体分子上有许多限制性核酸酶识别位点，便于多种DNA酶切片段的克隆。构建λ噬菌体克隆载体的基本策略：切去部分非必须的区域；抹去多余的限制性内切酶切割位点；插入可供选择的标记基因；建立体外包装系统。二、噬菌体载体λ噬菌体载体的类型（1）插入型载体：具有单一的酶切位点,可供外源DNA的插入。如：λgt10，λgt11，λZAP载体。载体长度37kb插入位点体外包装0-14kb（37–51kb）插入片段体外包装二、噬菌体载体（2）替换型载体：有成对的酶切位点，在两个酶切位点之间的DNA片段，可被外源DNA片段置换。如：λEMBL3，λEMBL4二、噬菌体载体λ-DNA作为载体的特点λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量——构建基因组文库λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因二、噬菌体载体2.M13噬菌体载体：是一种含单链DNA（ssDNA）分子的丝状噬菌体。这类载体主要用来获得大量的单链DNA片段，主要用来测定DNA序列（sanger双脱氧