第三章-载体

第二篇基因工程第三章载体•基因工程是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。分离或改建的基因和核酸序列自身不能繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。•常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。1.载体（Vectors）：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。2.载体的种类（基因工程中常用的载体有5类：）质粒（plasmid）、单链DNA噬菌体M13、噬菌体的衍生物、柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus）3.基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。（2）有选择性标记。（3）有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。（5）容易从宿主细胞中分离纯化。第一节质粒载体•一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。1.质粒的一般生物学特性（1）分子小：1—200kb（2）环形状：双链环状DNA。（3）质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）②开环DNA（opencircular，ocDNA）一条链上有一至数个缺口。③线形DNA（linear，lDNA）（4）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。二、质粒的复制类型1.严紧型质粒（stringentplasmid）：拷贝数少，只有1—3份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。2.松弛型质粒（relaxedplasmid）：拷贝数多，有10—60份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。三、质粒载体的构建1.天然质粒的局限性（1）分子量大，拷贝数低第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。（四环素）Tetr作为筛选标志，仅有1-2拷贝。（2）筛选标志不理想ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。插入外源基因后，失活。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞，在化学上相当麻烦，在实际操作过程中受到很大的限制。2.质粒载体必须具备的基本条件（1）具有复制起点（ORI）（2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。（3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。3.质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记①抗菌素抗性：绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：氨苄青霉素抗性（Ampr）;卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）;链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）（2）抗菌素选择原理不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。4.人工构建的质粒载体的类型1）高拷贝数的质粒载体•ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。•达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体•由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。pLG338、pLG339、pHSG415等，不适合大量扩增DNA用。•但有特殊用途:当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。（3）失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。1979年B.E.Uhlin等构建。如pBEU1、pBEU2。温度低（低于37℃），拷贝数很少；温度增加（40℃）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。（4）插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。（5）表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。①表达载体的结构1）强启动子，一个可诱导的强启动子可以使外源基因高效地转录2）在启动子下游和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD），促进蛋白质的翻译。3）在外源基因插入的序列下游有一个强转录终止子，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性。五、经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101：第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型：天然质粒，属低拷贝型。（2）长度9.09kb。（3）选择标记：四环素抗性Tetr（4）克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI。主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3个位于选择标记Tetr的内部）2.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体（1）元件来源①复制起点ori：pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点；②Ampr基因；③Tetr基因。（2）长度：4363bp（3）选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点：其中9个会导致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24个克隆位点。（5）pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记，插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamHI---Amp中存活---但在Tet中死亡外源基因PstI---Tet中存活---但在Amp中死亡用BamHI酶切，插入外源基因图在含A的平板上调若干单菌落，摇菌再涂含有T的平板上没长，说明外源基因已经连上，为我们所求。反之不是。②分子小，克隆能力大载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。③高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全：失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。3.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19（1）元件来源①复制起点：pBR322的ori②Ampr基因pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。③lacZ的启动子（大肠杆菌）④lacZ’基因：大肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。（2）长度:约2.7kb（3）克隆位点:10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。（4）选择标记：Ampicillin抗性和lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。蓝白斑选择原理：①Xgal②-半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。③lacZ的肽互补1）-肽（lacZ’）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）（不完整的肽链）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。2）受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal。受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a3）载体lacZ’与互补•pUC质粒载体上的lacZ’编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。•pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。•IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生肽！IPTG诱导的结果：•MCS无插入时，互补，蓝菌斑。•MCS有插入时，不互补，白菌斑。（5）pUC系列载体的优点①更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。②选择方便:：Xgal显色、抗菌素双重直接选择。③克隆便利：具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。六、其它质粒载体1.pGEM-3Z由pUC派生而来。与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。2.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvectors）（1）穿梭质粒载体的结构人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。（2）常用的穿梭质粒载体大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体、大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体、大肠杆菌动物细胞穿梭载体（3）穿梭载体的优点①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。七、质粒载体的不稳定性1.质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中。2.分离的不稳定性（segregationinstability）在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。减缓的程度与质粒的分子量成正比。丢失质粒的细胞反而会成为优势群体。3.结构的不稳定性（structuralinstability）•寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。•含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。•二聚体灾难（dimercatastrophe）：野生型E.coli中，质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒。二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。