肿瘤的血管生成

肿瘤血管生成的分子机制及常用研究方法重庆医科大学病理教研室叶秀峰肿瘤血管生成的分子机制及常用研究方法主要内容:第一节肿瘤血管生成的基本过程第二节肿瘤微血管形态和生物学特性第三节肿瘤血管生成的调控机制第四节抗血管生成疗法在肿瘤治疗中的应用第五节肿瘤血管生成常用研究方法人体肿瘤大部分为实体瘤。实体瘤瘤组织由瘤细胞和间质构成，后者主要包括血管、淋巴管、结缔组织、炎细胞及细胞外基质等成分。其中血管和结缔组织起营养、支持瘤细胞的作用。肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过血管生成(angiogenesis)和淋巴管生成(1ymphangiogenesis)实现的，并在肿瘤的生长和扩散(侵袭和转移)中起重要作用。已有研究证明，肿瘤血管生成活跃程度对组织病理分级、放射治疗以及在预后判断上都有重要的评估价值。第一节肿瘤血管生成的基本过程一、血管生成现象1945年Algire提出了“肿瘤血管生成(tumorangiogenesis)”或“血管新生化(neovasclarzation)”概念。对血管生成重要性的认识，特别是提出“肿瘤生长依赖于血管生成”观点，始于1971年Folkman对肿瘤血管生成的研究报道。血管生成是指活体组织在已存在的微血管床上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程即血管形成(vasculogenesis)。二．肿瘤血管生成的基本过程(一)血管生成的基本步骤：①血管生成因子的产生过多使之与抑制因子失衡，导致内皮细胞激活，产生血管生成表型；②血管部位细胞外基质改变、基底膜降解，内皮细胞芽生、增殖和迁移；③新生内皮细胞索形成管状毛细血管襻及管腔；④新生血管管腔的贯通。(二)肿瘤血管生成的过程1．肿瘤生长的阶段性①无血管期(avascularphase)或称血管前期(prevascularphase)肿瘤直径不超过1～2mm②血管期(vascularphase)肿瘤迅速生长并发生转移2.肿瘤血管的起源肿瘤中的血管可能有3种来源：①血管生成:以两种方式发生,一是肿瘤细胞团先处于无血管期生长，后因缺氧而产生大量血管生成因子，从而诱导血管生成；另一种是瘤细胞先依赖宿主组织已存在的血管生长，继而出现瘤内血管消退，然后再因缺氧诱导血管生成因子作用而发生血管生成。②血管套叠性生长③内皮祖细胞(endothelialprogenitorcell,EPC)EPC为血管内皮细胞的前体细胞,参与胚胎的血管生成,也称为成血管细胞。EPC主要来源于骨髓,表达CD133、CD34和VEGFR2。3．肿瘤血管生成的过程瘤细胞和巨噬细胞→血管生成因子(VEGF)等→小血管或毛细血管伸展→内皮细胞迁移形成毛细血管芽→新生毛细血管形成并连通。第二节肿瘤微血管形态和生物学特性肿瘤微血管不仅在形态上不同于正常血管，而且在生物学功能上也有其特殊性。一．肿瘤微血管形态表现肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组织，但分布上并不均一。血管生成最活跃、微血管密度最高的区域被称为所谓“血管热点区”(hotspots)，这也是进行肿瘤微血管密度测定的选择区域。很多肿瘤的微血管新生主要分布在肿瘤生长活跃的边缘。肿瘤的新生血管分布上常常无规律，分支紊乱，管腔不规则，表现为狭窄、扩张或扭曲。新生血管呈血窦状、条索状，管壁薄，甚至仅有一层内皮细胞；或管壁很厚，但结构上仍然不完善。内皮细胞比较幼稚，细胞间常有裂隙，且缺乏基底膜，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。肿瘤血管的结构缺陷是这些血管具有高通透性的结构基础，也是肿瘤转移途径之一。不同类型肿瘤间质血管没有本质区别，但在形态和数量上却有不同。生长活跃的恶性肿瘤常富于血管。如内分泌肿瘤、肾癌、骨肉瘤、绒毛膜癌、破骨细胞瘤、胶质母细胞瘤和肝细胞癌等。不同肿瘤血管的形态又有一定的差异，如胶质母细胞瘤中新生血管不仅丰富，而且内皮细胞呈不同程度的增生、肥大；绒毛膜癌、肝细胞癌等血管呈壁薄、明显扩张的血窦。总之，肿瘤微血管形态特点是：遍布整个肿瘤组织，但分布不均一，无规律，分支紊乱；管腔不规则，结构上不完善；内皮细胞比较幼稚，细胞间常有裂隙，且缺乏基底膜，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。肿瘤血管的结构缺陷是其具有高通透性的结构基础，也是肿瘤转移途径之一。二、肿瘤微血管的生物学特性①低反应性②高通透性③低供氧能力第三节肿瘤血管生成的调控机制一、血管生成因子(一)VEGF及其受体家族(二)细胞外基质与基质金属蛋白酶(三)Ets家族成员(四)纤维母细胞生长因子(FGF)家族及其受体(五)血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF)（六）其它血管生成因子二.血管生成抑制因子（一）大分子蛋白前体酶解片段(二)细胞因子（三）丝氨酸蛋白酶抑制剂（四）组织金属蛋白酶抑制剂（五）抑癌基因肿瘤血管生成受多种血管生成因子(angiogenicfactors)和血管生成抑制物(angiogenesisinhibitors)的调控。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧刺激等使局部微环境发生变化的因素作用而合成和释放大量血管生成因子从不同环节促进血管生成。组织中同时也存在内源性血管生成抑制因子，对血管生成起抑制作用。一、血管生成因子血管生成的始动需要血管生成因子。一系列血管生成因子、细胞因子、细胞外基质和黏附分子及其抑制物，以及代谢性和机械性因子均参与了血管生成过程。(一)血管内皮生长因子（VEGF）及其受体家族1．血管内皮生长因子家族血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）又称血管通透性因子(vascularpermeabilityfactor,VPF)，为分子量34-45kD的同源二聚体糖蛋白。VEGF基因通过转录水平的剪切，可产生5种变异体，即VEGF206、VEGFl89、VEGFl65、VEGFl45和VEGFl21，分别由206、189、165、145和121个氨基酸组成。其中以VEGF165最具特征性，其次是VEGF121二者均为可溶性分泌蛋白，扩散力强，易于到达靶细胞。近年又发现其他一些与VEGF功能相似、结构上有一定同源性的多肽因子，包括胎盘生长因子(placentorgrowthfactor，PIGF)，VEGF-B(VEGF相关因子，VEGF-relatedfactor，VRF)，VEGF-C(VEGF相关蛋白，VEGF-relatedprotein，VRP)，以及VEGF-D／FIGF和VEGF-E等成员，它们共同构成VEGF家族。VEGF主要由血管周围的细胞产生，并通过旁分泌机制作用于内皮细胞，在促进血管形成、抑制内皮细胞的凋亡及提高血管通透性等方面发挥重要作用。2．VEGF受体类型：VEGF只有与其特异性受体结合后才能发挥生物学功能。目前，已鉴定并克隆出3种受体，即VEGF受体l(VEGFR-1，又称flt-1)、VEGF受体2(VEGFR-2，又称flk-1或KDR)及VEGF受体3(VEGFR-3又称flt-4),均属酪氨酸激酶受体，称为Flt家族。前两种受体一般只表达于血管内皮细胞表面，但偶尔在其它类型细胞，如肿瘤细胞中也有表达；Flt-4在胎儿早期静脉的内皮细胞上呈一过性表达,胎儿后期和出生后的内皮细胞则不再表达；在成人Flt-4只在淋巴管的内皮细胞上表达。由于Flt家族基因的表达部位不同，其配体的结合部位也不同。早期血管的形成需要VEGF的调节，它们与内皮细胞上相应的酪氨酸激酶受体结合，引起内皮细胞分裂和分化，并形成管腔样结构。在胚胎发育过程中，VEGF(主要是VEGF-A)通过其受体VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1／KDR)促进内皮分化、增殖、迁移和原始血管形成。由新形成的内皮组装成管腔样结构需要VEGFR-1的表达和激活，而VEGFR-3的表达与内皮细胞形成静脉或淋巴管有关。VEGF不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原，而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中发挥重要作用。VEGF在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆有过表达。VEGF及其受体在肿瘤中的表达常与肿瘤分化程度密切相关。大多数实体瘤VEGF基因均有过表达，VEGF165、VEGF121两种VEGF最常见。在VEGF家族中，VEGF-C和VEG-D既可诱导血管生成，又可诱导淋巴管生成。已有研究报道，人体多种肿瘤细胞高表达VEGF-C。体内转基因实验也证实，肿瘤细胞VEGF-C的高表达能选择性地诱导肿瘤组织淋巴管生成。肿瘤组织中的VEGF-C和VEGF-D还来源于浸润的巨噬细胞。缺氧是许多细胞系产生VEGF的一个强烈的诱导因子。离体条件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表达的诱因。VEGF在肿瘤坏死灶周边常呈强表达。肿瘤中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平常与VEGF呈正相关，NO与VEGF之间具有相互调节作用。多种癌基因的激活通过上调VEGF表达而诱导血管生成，失活的抑癌基因(如突变型p53基因)也参与了VEGF介导的血管生成过程。(二)细胞外基质与基质金属蛋白酶1.细胞外基质：人体各种组织均由细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)构成支架，根据其分布部位、组成成分及功能的不同可将其分为基膜(BM)和间质结缔组织两大类。ECM成分由4大家族组成：胶原蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白、ECM糖蛋白。目前发现ECM糖蛋白有10余种，如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)等。其中FN主要分布于皮肤、肌腱、血管壁和骨基质等组织。多数ECM糖蛋白具有粘附功能，这种功能的发挥与其分子内部含有的某些特殊的蛋白片段有关，通过这些片段，ECM糖蛋白就可以与细胞及ECM其它成分结合，参与细胞的粘附、迁移、生长和分化。2.基质金属蛋白酶的家族成员：随着现代基础医学科学理论和实验技术的飞速发展，大量的MMPs被发现、分离、纯化及测序。它们广泛地分布于动植物界，几乎能降解所有生物体内的ECM成分。到目前为止，MMPs家族至少包含20种酶，而且其新成员仍在继续增加。3.基质金属蛋白酶的促新血管形成作用：电镜观察显示，新的毛细血管围成环状及新合成的细胞外基质成分沉积、铺垫后，血管环前端新合成的BM就开始了MMPs所介导的蛋白水解过程，内皮细胞迁移将始于局部水解，形成一个新的毛细血管芽，随后又经历了一系列细胞外蛋白水解酶的活化与抑制的动态循环。体外细胞培养发现，当将人脐静脉内皮细胞培养于BM样物质上时，内皮细胞很快排成直线，围成管状，编织成血管网。4.MMPs在不同癌组织中的表达：人类癌组织种类繁多，研究癌细胞所产生的各种MMPs分子的特点及其在各种癌组织中的分布情况，对了解癌的浸润和转移过程有重要意义。已有资料表明，不同种类的癌细胞所表达的MMPs分子种类和表达量也不相同。例如:乳腺癌:MMP-7，-8及-13表达量明显高于正常乳腺组织。5.MMPs激活与癌的浸润和转移：多数癌组织中潜在型MMP-2的激活程度是癌发生转移的重要指标。因此检测癌组织内MMP-2活化酶MT-MMP对癌的治疗具有重要意义。(三)Ets家族成员Ets原癌基因于1983年分别在不同的实验室中分离成功。迄今发现至少有Ets-1、Ets-2等11种Ets基因家族成员。Ets-1与新血管形成：血管周围基膜的分解和内皮细胞本身的迁移力是血管生成的两个关键因素。前者主要与MMPl有关，后者则主要与Ets-1有关。已发现的4种典型的血管生长因子aFGF、bFGF、VEGF及EGF都能调节人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、ECV-304细胞以及人网膜微血管内皮细胞中的ets-1mRNA的表达。上述培养的细胞当受到生长因子等刺激时，2小时后其ets-lmRNA的表达呈最高值，12小时后又恢复到原来水平。如用VEGF刺激培养的内皮细胞时，其DNA-Ets复合物明显增多；而用VEGF和GGAA(Ets功能域的竞争性抑制剂，controlcompetior)，同时刺激培养的内皮细胞时，DNA-Ets复合物的量则明显