重组DNA技术

1重组DNA技术首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系2重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱34GoldenRiceisModifiedtobeProvideaDietarySourceofVitaminAWorldwide,7%ofchildrensuffervitaminAdeficiency,manyofthemlivinginregionsinwhichriceisastapleofthediet.Goldenrice(yellow)withstandardrice(white).4重组DNA技术是对DNA或基因进行操作，又是在分子水平上操作，因此又称为：DNA克隆DNAcloning基因克隆genecloning分子克隆molecularcloning5克隆（clone）在细胞学中，指通过无性繁殖过程产生成千上万个与亲代完全相同的子代群体。这一群体中的所有细胞具有完全相同的基因型和表型。（或指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞群体的过程）细胞学中克隆的概念6重组DNA技术的概念（RecombinantDNAtechnology）应用酶学方法，按照人的意愿，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作组装成新的DNA分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子、以获得该DNA分子的大量拷贝的过程。7重组DNA技术（DNA克隆）的主要目的是获得某一基因或DNA的大量拷贝。不同来源的DNA共价连接形成的新的DNA分子称为重组DNA（RecombinantDNA）。8DNA克隆的策略与技术路线1、获得目的基因/目的DNA2、目的基因与载体的酶切3、目的基因与载体的连接4、重组DNA分子导入受体细胞5、筛选和鉴定含重组DNA分子的受体细胞克隆9DNA克隆的基本过程1、分：分离目的基因2、切：对目的基因和载体适当切割3、接：目的基因与载体连接4、转：重组DNA转入受体菌5、筛：筛选出含有重组体的受菌体10HumanInsulinProductionbyBacteria11HumanInsulinProductionbyBacteria6)jointheplasmidandhumanfragmentandcutwitharestrictionenzyme12HumanInsulinProductionbyBacteriaMixtherecombinantplasmidwithbacteria.Screeningbacterialcellstolearnwhichcontainthehumaninsulingeneisthehardpart.13RoutetotheProductionbyBacteriaofHumanInsulinAfermentorusedtogrowrecombinantbacteria.Thesinglecellwithmanyrecombinantplasmidsproducestrillionsoflikecellswithrecombinantplasmid–andthehumaninsulingene.Onecellwiththerecombinantplasmid14RoutetotheProductionbyBacteriaofHumanInsulinThefinalstepsaretocollectthebacteria,breakopenthecells,andpurifytheinsulinproteinexpressedfromtherecombinanthumaninsulingene.美国礼来(Lilly)公司优泌林(Humulin)15第一节基因克隆重要的工具酶16限制性核酸内切酶DNA聚合酶ⅠKlenow片段逆转录酶TaqDNA聚合酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶DNA聚合酶修饰酶工具酶在重组DNA技术中有特殊的用途17一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease，RE，限制酶）定义:一类能识别双链DNA分子中特定DNA碱基序列，并水解该序列内部或附近的磷酸二酯键的核酸内切酶。特点:识别特定碱基顺序（限制位点）切割双链DNA（磷酸二酯键）核酸内切酶（内部切割）18根据限制性酶的识别切割特性、催化条件以及是否具有修饰酶活性，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。通常所指的限制酶为Ⅱ型限制性内切酶。（一）限制酶的分类191.I型限制酶:具有限制和修饰活性辅助因子:Mg2+、ATP和SAM识别和切割位点不一致:在DNA链上没有固定的切割位点，一般在识别位点外1Kb至7Kb处随机切割，不产生特异片断。有甲基化作用202.II型限制酶：即通常所用的限制性内切酶；分子量小。辅助因子:Mg2+切割位点在识别位点内：能识别和切割双链DNA的特异序列，产生特异的DNA片断。无甲基化作用213.III型限制酶：具有限制和修饰活性分子量大切割位点在识别位点3’末端外依赖ATP有甲基化作用22第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序；前三个字母用斜体。（二）限制酶的命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶23（三）II型酶的识别、切割功能(1)以核酸内切方式水解磷酸二酯键，产生的DNA片段，5’端为P基，3’端为OH基。(2)识别序列一般为4～8bp，通常具有回文结构(Palindrome)24(3)切割DNA双链可产生2种末端平末端（bluntendsorflushends）5’AGCT3’AluⅠ5’AGpCT3’3’TCGA5’3’TCpGA5’粘性末端（stickyendsorcohesiveends）沿识别序列的对称轴，对DNA的双链同时交错切割，产生具有互补碱基顺序的游离的单链末端。255'端突出的粘性末端5′GGATCC3′BamHI5′GpGATCC3′3′CCTAGG5′3′CCTAGpG5′３'端突出的粘性末端5′GAGCTC3′SacⅠ5′GAGCTpC3′3′CTCGAG5′3′CpTCGAG5′26识别顺序大小切割几率4bp44=2566bp46=40968bp48=65536平均相距4n个核苷酸长度出现一个识别顺序按限制酶识别顺序的大小估算限制酶的切割几率27异源同裂酶（isoschizomer）1、定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2、特点：1）识别相同顺序2）切割位点相同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGGBamHIGGATCCBstIGGATCC28同尾酶（isocaudarner）5’G3’CAGCTTCGAG3’C5’+5’GTCGAG3’3’CAGCTC5’2、特点：1）识别不同顺序2）切割后的配伍末端相同SalIGTCGACCAGCTGXhoICTCGAGGAGCTC1、定义：酶的来源不同，识别序列不同，但切割DNA后可产生相同的粘性末端（称为:配伍末端compatibleend）29（四）影响限制酶切割效率的因素1、底物纯度2、底物甲基化程度3、底物结构4、反应温度5、反应体系组成30内切酶的缓冲液：10×Tris-HCl、NaCl、MgCI2pH为7.2-7.6离子强度分为三个级别低盐（10mmol/LNaCl）中盐（50mmol/LNaCl）高盐（100mmol/LNaCl）31二、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)指以dNTP为底物，催化dNTP聚合生成DNA的一类酶。321、大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNApolymeraseI，全酶）分子量为109kD，具有三种活性的多功能酶5’→3’聚合酶活性3’→5’外切酶活性5’→3’外切酶活性用途：(1)用切口平移方法标记DNA探针(2)合成第二条cDNA(3)DNA测序332、Klenow片段（大肠杆菌DNA聚合酶I大片段）作用：5’→3’聚合酶活性3’→5’外切酶活性用途：（1）补平或标记5’粘端（2）在cDNA克隆中，用于cDNA第二链的合成（3）DNA序列测定343、TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase)特点：耐热的DNA聚合酶，最佳作用温度75-80C。具有5’3’聚合酶和5’3’外切酶活性，缺乏3’5’外切酶活性，因而无校正阅读功能。用途：（1）PCR（2）DNA序列测定354、逆转录酶(ReverseTranscriptase,RTase)特点：以mRNA作为模板,以dNTP为底物，RNA指导的DNA聚合酶(RDDP，RNA-dependentDNApolymerase)种类：禽成髓细胞瘤病毒（AMV）Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV)用途：（1）逆转录合成cDNA（2）补平或标记5’粘端（3）DNA测序（4）制备探针363738三、DNA连接酶(DNAligase)作用：催化两个相邻DNA片段的3’-OH与5’–磷酸基之间形成3’，5’磷酸二酯键。种类：T4DNA连接酶(辅助因子ATP)大肠杆菌DNA连接酶(辅助因子NAD+)39四、修饰酶T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）末端转移酶(terminaltransferase)40T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)催化将ATP的γ-磷酸转移到DNA链的5’-末端。用途：（1）放射性标记DNA链的5’-末端，用于DNA测序或探针制备。（2）将人工接头和其它没有5’-末端磷酸的DNA片段磷酸化，用于连接反应。41碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）作用：催化切除DNA、RNA的5’磷酸基团种类：BAP（bacterialalkalinephosphatase）CIP（calfintestinealkalinephosphatase）用途：1.从RNA或DNA上除去5’磷酸，防止酶切后DNA的自身环化2.与T4多核苷酸激酶联合，用于放射性标记DNA链的5’末端。42不依赖于模板的DNA聚合酶——末端转移酶(terminaltransferase)作用：催化dNTP掺入到DNA的3’-OH端用途：1.给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴2.DNA片段的3’末端标记43（一）RNase用于除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。1.RNaseA除去DNA样品中的RNA分子2.核酸酶S7除去蛋白质合成系统中的内源mRNA五、核酸酶（nuclease）DNaseRNase（二）RNaseH作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。44（三）DNaseI1.特点：内切酶，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异型（随机切割），产生5’-磷酸脱氧寡核苷酸。2.用途：1)切口平移法，制备DNA探针2)制备RNA样品时除去DNA分子45重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性内切核酸酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性