分子克隆技术实验讲义2016.3(最终版)

1分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。2、学习和掌握质粒、T载体的特点。3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。二、相关知识（一）T载体的制备pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物（T-ACloning）的商业化专用载体，由pΜC18载体改建2而成。在pΜC18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点，用EcoRⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatibleend），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。（三）大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（competentcell）是经过一定方法处理后，具有接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（DMSO、MnCl2、TBaq、PEG）等。（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反应后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的分析，若把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产生克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同的克隆进行筛选，就可以鉴定所需的重组DNA分子。所谓的重组子（recombinant）也叫做转化子（transformant）是指吸收了重组DNA分子的转化细胞。将重组子从其它细胞群中（如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片3段）分离出来，并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选（screening）。根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。相关知识点：①转化（transformation）质粒（plasmid）②转染(transinjection)噬菌体（phage）③显影注射（1）导入的方法④电转化2.5kv⑤基因枪geneblaster⑥脂质体介导法⑦其它方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法（2）重组子：转化子（3）重组反应体系中的成分：①②③④⑤⑥（4）筛选的方法DNA鉴定筛选法：定位、测序①直接筛选法选择性载体筛选法：λph包裹、抗药性α-互补分子杂交筛选法：ISH、SouthernBlot免疫化学免疫学方法②间接筛选法酶免疫检测mRNA翻译检测法（五）质粒DNA的提取（碱裂解法）原核生物没有真正的细胞核，DNA一般位于一个类似“核”的结构——称为类核体上（因为不是一个完整的细胞核）。E.coli的遗传物质主要是染色体DNA，E.coli的染色体为双股环状DNA，含有1400个以上的基因，另外还有一些质粒DNA。1、质粒的概念质粒是细菌（如E.coli）染色体外的小型环状双链DNA分子。一般说来，质粒不是细菌生长繁殖所必须的结构，就细胞生存而言，质粒是可有可无的。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，故能在细菌内独立地进行复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。2、研究质粒的意义（1）质粒作为一种裸露的，比病毒更简单、更有自主复制能力的DNA分子，正好处于生命与非生命的分水岭上。由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息，说明质粒是独立的有机体，是亚细胞生命体系的成员，是比病毒更简单的原始生命形态，所以质粒是研究生命起源的一块重要的基石。4（2）要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体。由于质粒具有遗传传递和遗传交换的能力，因此，质粒作为基因工程的重要运载工具，在现代分子生物学占有重要地位。3、质粒的分类不同的质粒在宿主细胞中的拷数也不同，根据质粒在细胞中拷贝数的多少，Rownd（1969）把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒。（1）严密型质粒（stringentplasmid）：严密型质粒多半是一些具有自身传递能力的大质粒，其DNA的复制与宿主染色体DNA的复制相偶联，受到某种程度的控制，每个细胞仅有1-2个拷贝。（2）松驰型质粒（relaxedplasmid）：松驰型质粒多半是分子量较小、不具传递能力的质粒，其复制是在松驰控制下进行的，每个细胞的拷贝数约为10～200个。当向培养基中加入氯霉素时，细胞的蛋白质合成被抑制，细胞染色体DNA和严密型质粒DNA的复制停止，松驰型质粒DNA的复制继续进行。松驰型质粒DNA的拷贝数可达数百个，基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒。相关知识点：（1）质粒的分类：①与宿主相关程度：严密型质粒（stringentplasmid）、松弛型质粒（relaxed）②是否有转移基因：接合型质粒、非接合型质粒③带有特殊用途的基因：生殖质粒（F质粒）、抗性质粒（R-质粒）、col质粒（编码杀死其他细菌的蛋白质）、降解质粒、致病质粒（Ti）（2）质粒的提取方法：煮沸法、CsCl、试剂盒、碱裂解法；（3）质粒的构型：①SC构型：cccDNA(covalentlyclosedcircleDNA)②OC构型：ocDNA(opencircleDNA)③L构型：L-DNA(linearDNA)三、实验原理（一）T载体的制备OCLSC5XcmⅠ是一种Ⅲ型的限制性核酸内切酶，其识别序列为：5′-CCANNNNN^NNNNTGG-3′3′-GGTNNNN^NNNNNACC-5其中阴影部分为XcmⅠ的识别序列，“^”为XcmⅠ的切割位点，其识别序列中间的9个任意核苷酸（N）对XcmⅠ的酶切特异性及酶切效率没有影响。为了能得到用XcmⅠ酶切后3′末端均是T的载体，本实验利用了XcmⅠ的识别序列的特点，引物的3′端带有XcmⅠ酶切位点，其序列如下：Primer1：5′-CGCCCATGCTA^GCGCTGGTAAT-3′Primer2：3′-TCTCTAAGGTATGC^ATATGACCCGC-5′引物中“^”为XcmⅠ的切割位点，当XcmⅠ对PCR得到的线性片段进行酶切的时候，便会产生一个与T载体形式完全一样的3′-T粘性末端。（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）1988年，Clarke发现所有的PCR产物都在TaqDNA聚合酶的作用下在3′端附加上了一个3′突出的腺苷酸，因为TaqDNA聚合酶具有非模板介导的核苷酸转移酶活性，可在双链DNA末端加上一个单一的3′突出的dATP，利用TaqDNA聚合酶的这一特性，在克隆载体上附加3′胸腺嘧啶（dTTP）形成T-A克隆系统，即可直接对PCR产物进行有效的克隆，这样的载体称为T-载体。（三）大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备技术是从20世纪70年代初期发展起来的，当时人们发现如果把E.coli细胞浸在一冰冷的盐溶液，它吸收DNA分子的能力要比不浸的细胞强；经过摸索和总结，人们终于采用50mmol/L的氯化钙（CaCl2）溶液来制备感受态细胞。其他的盐（如氯化铷RbCl）也很有效。尽管对这一处理的确切机制仍不清楚，但有人对感受态提出了两种假说，一种认为是细菌细胞壁的局部失去了壁结构或局部溶解，让外源DNA分子通过质膜进入；另一种认为DNA分子能进入细菌细胞是由于细胞处6于感受态时表面形成了一种可接受DNA的酶位点。一旦细胞被处理制备成感受态细胞，它们就能稳定地摄取外源DNA分子了。（四）重组DNA的转化及重组子的鉴定转化是使重组体DNA分子在热休克的短暂时间内被导入受体。一般认为DNA分子在转化过程中将经历四个阶段，第一个阶段是吸附阶段，完整的双链DNA分子将吸附于感受态细胞的表面；第二个阶段为转入阶段，双链DNA分子解链，以单链的形式进入细胞，而另一链则被降解；第三阶段是自身稳定阶段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA；第四个阶段是表达阶段，即目的基因随同质粒的复制子一起复制。有些株系的E.coli尽管用抗生素抗性基因的插入失活法来筛选重组子很方便，但有的质粒还是采用了其他基因进行筛选，效果同样不错。以pΜC8载体为例，它除了含有氨苄青霉抗性基因以外，还含有一个称为LacZˊ的基因。该基因编码β-半乳糖苷酶的一部分。半乳糖苷酶参与的将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的生化过程，本来是由E.coli染色体上的LacZ基因编码。有些株系的E.coli带有修饰过的LacZ基因（即缺少LacZˊ的LacZ基因），只编码β-半乳糖苷酶的α-肽。这些株系的E.coli细胞只在有吸收了像pΜC8这样带有LacZˊ基因的质粒分子的情况下才能够合成完整的β-半乳糖苷酶。因此在筛选pΜC8的重组子时，先将转化子涂布于含有氨苄霉素的培养基上培养，然后再通过检测β-半乳糖苷酶的活性来选择重组子，既能抗氨苄霉素，又能合成β-半乳糖苷酶的细胞就是重组子细胞。现代化学的发展给我们提供了非常直接地检测β-半乳糖苷酶活性的方法，这种方法涉及一种乳糖的类似物——5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（5-bromo-4-chLoro-3-indoLyL-β-D-galactopyranoside），因为它的英文名太长，所以人们就用X-gal来代替它的长名。β-半乳糖苷酶可以将X-gal分解成一种深蓝色的产物，这个反应是很灵敏的。当带有氨苄青霉素的培养基中加有X-gal及一种β-半乳糖苷酶的诱导物（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG）时，那些