第六章-代谢网络的定量分析

第六章代谢网络的定量分析复杂的网络代谢理论为系统研究微生物提供了新的平台。代谢网络应用主要是生物体内发生的多个化学反应的总和。根据研究目的的不同，代谢网络可以表达成三种不同形式的图：代谢物图、反应图、二分图。代谢物图是把代谢网络中的代谢物看成是图的边；反应图是把酶看成图中的结点，连接两个连续反应的中间复合物看成是图的边；二分图是把代谢物和酶看成两种不同类型的结点。用代谢网络定量分析的方法来解释细胞代谢的调控日益引起重视。在国外，1994年NIESON将代谢工程的定量分析方法，作为单独的一章加以介绍。近几年代谢网络定量分析法发展迅猛，各种方法不断涌现、发展，国内在1996年7月的第七届全国生物化工学术会议上才有涉及定量分析的研究论文出现。代谢网络途径分析从简单地分析代谢反应挂图已发展到最近的深入研究代谢网络结构的理论。代谢途径的确定于提供一个以整个代谢功能和表型为出发点进行途径定位方法是必不可少的。对于这种鉴别和分析的方法，最有发展途的是利用凸分析原理，这些原理包括最近提出的元素模概念和极端途径模型，两者都能用于确定代谢网络的生产力的界限。途径分析用到一些数学概念，如零空间和凸多面的应用，途径分析在基因识别和生物技术上有很大应用前途由于对细胞代谢结构的深入理解和巨大的基因组信息在当可被利用，生物化学家和生物技术家将能得出细胞的完整代谢图并通过合理、定向的代谢工程来对它进行重新设计。代谢网络应用理论基础显然，利用数学工具进行分析是一个重要的方面。1960，匈牙利数学家艾尔德(P.Erdǒs)和莱利(A.Rényi)提出，用随机作图理论来分析网络的拓扑复杂性。他们的这一理论后来成为分析网络的经典数学方法，被称为“ER理论”，其研究的网络则被称为“ER模型”。ER模型建立在随机过程上，即一定数量的节点彼此完全随机地连接在一起，每个节点具有相同数量的连接。因此，这种模型在统计意义上是一种均一性网络。最近几年，随着大量数据的产生和计算机的应用，人们发现在现实世界里真实的网络与ER模型相差甚远。这些真实的网络既不是概率为零的绝对规则连接网络，也不是概率为1的完全随机连接的网络，而介于这两者之间。科学家把种类型的网络称为“小世络”(small-worldnetwork)。研究者发现，线的神经网络就是一种典型的小世界网络。许多自然状态下的网络还表现出一特别的属性：少数节点的连接数远高于平均的节点连接数。这类网络被称为“由规模网络”(scale-freenetwork)，属于高度非均一性的网络。它具有真网络中最常见的两个特性：增长(growth)和偏好连接(preferentialattachment研究者利用基因组数据库，对动物、植物、微生物三大类型中的43种生物体的谢网络进行了分析，发现这些代谢网络均遵循着自由规模网络的设计原则。代谢网络研究的主要研究成果近几年，在代谢网络方面国外作了大量的研究。H.Jeong,H.Tombor等利用SAYTHS技术研究了43种生物的细胞代谢网络得出：1、它们都是自由规模网，这些网都是强健的和耐受出错的(error-tolerant)，也就是抗干扰的。2、具有小世界特性：任何两个底物(节点)都可以有少量的代谢反应(连接点)与其连接。3、高度连接的是底物而很少连接的则是种属特异性酶的产物。4、生物网络都是统计异质的，也就是说不同的节点由不同的连接数(k),符合倍数定律分布，也就是说在这样的网中，新的节点偏向于和已经连接了节点的节点连接。此种网即强健又具有抗出错能力。5、所有已测定的43种生物的代谢网络的结构和规模都是一样的。6、所有已测定的生物的平均连接数目(两个节点之间的连接数目)都意外地相近，在3左右。7、如果一种底物(节点)由于催化其反应的酶的突变而突然降低，则很快就可能有一条最短的生化代谢途径和少数新酶的表达，通过更大的网络半径来补救。8、E.coli代谢网络计算机模拟和在体突变(Insilicoandinvivomutagenesis)研究表明，细胞可以耐受若干代谢酶的删除。9、拥有最多连接的节点也就是“hubs”在所有已测生物中都一样。对于微生物的蛋白质之间的互作网研究表明，自由规模网有惊人的对抗意外损伤的能力，即使80%的随机选定的节点断裂，保留的20%仍能形成互联簇，使任何两个节点间连接。当然，这一特征依赖于hubs。在酵母菌中，0～10%的蛋白质少于5个连接，大于60%的多于15个互连（互相作用），这表明蛋白的互连度在决定缺陷基因表型中具有重要作用，只有～18.7%的酵母基因（～14.4%的大肠杆菌基因）缺失使细胞致死。很多大肠杆菌的基因同时缺失甚至不会发生任何表型变化。证明很多基因在自由规模网中不具有主要作用。由于代谢网络结构是一种并行的结构，加上生物体本身的复杂性，单靠单一的定量分析方法对复杂网络很难得出完美的优化结构。从国外研究来看，定量分析方法本身尚处于不断发展中，新的方法也不断出现。这些方法的出现、发展、完善，再加上与新的并行处理方法，如神经网络、遗传算法、进化规则、细胞自动机模型、计算机技术等方法结合，代谢工程定量分析必然会有更大的进展，从而为发挥代谢工程的潜力和代谢工程的广泛应用开辟广阔的前景。一、代谢网络定量分析的研究意义与目的在由代谢途径组成的代谢系统中，往往几种调控机制同时发挥作用传播到整个代谢系统。因为在分子水平上影响代谢通量的因素众多，在确定的环境中，对通过特定的代谢途径的代谢通量变化往往存在各种各样的解释。如果这些解释使用的是定性的方法，就很难对这些解释进行评价了。在这种情况，用代谢网络定量分析的方法来解释细胞代谢的调控日益引起重视。在国外1994年Bailey在Science中将代谢工程的定量分析方法，作为单独的一章加以介绍。近几年代谢网络定量分析法发展迅猛，各种方法不断涌现、发展。国内，在1996年7月的第七届全国生物化工学术会议上才有涉及定量分析的研究论文出现。鉴于代谢网络定量分析在代谢工程中的基础性作用，下面将具体介绍国内外近几年在该方面的研究进展。★二、代谢网络定量分析的基本理论★代谢控制分析（MCA）的基本理论及应用★代谢通量分析（MFA）的基本理论及应用★生化系统理论（BST）的基本理论及应用★控制论模型（CM）的基本理论及应用★途径分析的基本理论及应用★㈠代谢控制分析（MCA）的基本理论及应用MCA是在生化反应系统敏感性分析的基础上发展起来的，是研究分析代谢途径中代谢控制在各个反应步骤之间如何分配的理论。这一理论可以用数学形式表达，也可以同实验方法结合对细胞代谢的调控问题提出定量的解释。随着对复杂代谢现象认识的需要和在生物技术中研究和应用实例的积累，代谢控制分析理论日益引起广泛的关注。基本理论MCA的基本研究对象是由代谢反应步骤以及代谢反应途径组成的代谢系统，单个反应步骤是组成系统的基本单元。MCA认为代谢系统中所有反应步骤都对代谢通量和代谢物浓度进行控制，因此对其中一个反应步骤施加微扰而产生的代谢通量（或代谢物浓度）变化的大小，可以作为代谢系统分析理论的基本概念。根据以上概念，在假设代谢系统是直线式代谢途径（恒态代谢系统中任何两个反应步骤是通过唯一的共同中间代谢物连接的），而且系统内代谢物是均匀分布的基础上，可以导出总和原理和连通原理。这些概念和原理就形成MCA理论的基本形式。根据MCA理论,代谢控制是细胞内代谢的系统属性,并可以用酶动力学性质进行定量表示。MCA指出了“限速步骤”观念的局限性,认为代谢途径中酶促反应步骤对代谢的控制作用随系统内外条件的改变而变化。用理论计算或试验确定的控制系数能够加深对代谢的控制结构特性的理解。代谢控制分析定义了一些重要的表征参数，如通量控制系数、浓度控制系数、弹性系数等，它们分别表示某一酶水平变化对速率分布或浓度分布的影响及底物浓度变化对速率分布的影响。通过对其进行比较即可找到限制性步骤和关键酶，为代谢工程提供了目的位点。利用加和原理、连接原理等可由某些参数确定那些难以直接测量的参数。控制系数是指在生理条件(即某一恒态)下，对代谢系统中某一步反应施加一个微小扰动，所引起指定的代谢通量或代谢物浓度的相对变化与该反应的反应速度Vi相对变化之比：上式中如果A代表指定的代谢通量，则称为该步骤关于这个通量的通量控制系数。上式中如果A代表指定代谢物的浓度，则其称为该步骤关于这个代谢物的浓度控制系数。弹性系数是指在一个与代谢系统中某一步反应具有相同参数的酶促反应中，对该反应某一参数p(如底物、产物、酶浓度、温度、效应物等)进行微扰，所引起的反应速度Vi的相对变化与该参数的相对变化之比，即:而总和原理与连通性原理则是在假设代谢系统是直线式代谢途径(恒态代谢系统中任何两个反应步骤是通过唯一的共同中间代谢物连接的)，系统内代谢物是均匀分布的情况下推导出的。①局限性⑴控制系数是否可以描述代谢的调节与控制，这在MCA出现伊始就引起质疑，其原因包括以下两点：①与变构酶的效应物作用相比，酶浓度不是对代谢调控特别有影响的参数；②控制系数是否可以作为代谢控制的标准值得怀疑，因为控制系数只在测量条件下有效，并且随着系统状态的变化而变化，因此是作用有限的预测值。有学者认为代谢网络中的调控作用不一定是通量控制。⑵当涉及MCA的连通性原理时，要求对代谢系统中的所有反应及酶与代谢物的中间反应等都鉴别清楚。而在实际应用中，一般典型生物的代谢知识太少，对其他具有利用潜力的生物更是所知不多。这是MCA理论应用的“瓶颈”。目前已经发展了一种称为“自上而下”的实验方法拓展了MCA的应用前景，可以用来对复杂代谢系统进行代谢控制分析。⑶MCA在指导代谢工程方面的能力还存在问题。MCA只能处理恒态下的代谢系统，并且代谢通量的控制分布只能在对反应速度微扰的情况进行评估，所确定的控制系数只对该恒态有效，所以在代谢工程中用MCA来指导另一种恒态下代谢系统的调整是有疑问的。此外，以MCA为设计基础的代谢工程多集中在对酶浓度的调整上。但是通量控制系数较大的酶有时不能进行调整，如在具有反馈抑制机制的直线式代谢途径中，受抑制的酶常常控制着代谢通量。通常的做法是考虑解除反馈抑制，而不是提高受反馈抑制的酶的活力。目前在MCA中有学者运用了一种定位诱变(site-directedmutagenesis)的策略来解决此问题。②应用MCA的重要特点之一是能够结合具体酶的反应动力学性质，来说明代谢网络特性。如利用与代谢网络中某一步反应具有相同参数的酶促反应的速度方程求导得到弹性系数，或通过体内实验测定弹性系数，利用连通性原理可以确定网络中的控制系数。随着理论研究的深入发展，代谢控制分析已经大大突破原有假定条件的限制，发展到可以对含有分支途径、循环、酶-酶相互作用、级联反应等各种结构形式的代谢系统进行代谢控制分析。MCA在研究复杂代谢网络中的进展，不仅加深了对代谢网络中控制结构的了解，而且对不同代谢系统类型的控制分析更加系统化，形成了所谓的矩阵方，并且促进了计算机技术在这一领域的应用，显示出MCA应用于代谢网络分析和评价的广阔前景。★代谢途径中的限速步骤MCA的研究突破了传统的限速步骤观念,使人们对代谢的调控有了更加全面的认识。长期以来,人们一直认为代谢途径存在着固定的限速步骤,它们控制着通过代谢途径的代谢通量,主要表现在:限速步骤的反应速度很低,整个系统的代谢通量取决于此步骤酶的活性;限速步骤是热力学不能进行的反应,具有很高的平衡常数,需要由与其偶联的、热力学上容易进行的反应驱动;限速步骤受制于该步骤酶活性与酶合成的调节。㈡代谢通量分析（MFA）的基本理论及应用因为代谢通量是构成细胞生理学的基本决定因素，所以体内途径通量大小的精确量化是细胞生理学和代谢工程中一个重要目标，尤其是从代谢生产的角度看，总是希望尽可能的将底物转变成有用产物。代谢通量分析（MFA）是代谢途径通量确定的一个强有力的方法，因此，通过利用主要胞内反应的化学计量模型及应用围绕代谢物的质量平衡关系，就可计算出胞内通量。基本理论代谢通量分析是根据