重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及SH-SY5Y细

No.51617交流论坛交流论坛重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及SH-SY5Y细胞的转染摘要关键词目的采用RT-PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA，并克隆到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中，经酶切鉴定及测序分析对重组质粒pEGFP-GDNF作进一步鉴定。采用电转方法将重组质粒pEGFP-GDNF转染至SH-SY5Y细胞。胶质细胞源性神经营养因子/生物合成，逆转录-聚合酶链反应、遗传载体，重组，遗传，基因疗法，融合蛋白转染细胞构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因的真核细胞表达载体，为应用GDNF进行如帕金森综合症之类的神经元退化性疾病的基因治疗打基础。结果大鼠GDNFcDNA已正确地克隆到真核表达载体pEGFP-C1中，而构建成重组大鼠质粒pEGFP-GDNF。GDNF基因在细胞中可稳定表达。方法真核细胞表达载体pEGFP-GDNF以及表达GDNF工程细胞SH-SY5Y的成功构建，为进一步开展GDNF基因治疗脑缺血疾病的研究奠定了基础。胶质细胞源性神经营养因子（glialcellline-derivedneurotrophicgrowthfactor，GDNF）属于TGF-β超家族成员，最早由小鼠胶质细胞株B49细胞分离并命名。这种蛋白质具有很强的促多巴胺能神经元存活的作用。随着研究的深入，发现它具有广谱性神经营养作用[1,2]。它不仅作用于多巴胺神经元，而且对周围神经系统运动神经元和感觉神经元的发育，存活和再生有促进作用。在脑缺血的研究中，发现GDNF参与神经修复过程，并发挥神经保护作用。GDNF可以调节酪氨酸羟化酶的表达，有实验表明海马内注入GDNF后，降低了缺血诱发的THmRNA水平；海马局部用GDNF处理，也减少了TH样免疫阳性反应[3]。另外GDNF还有抗NMDA的细胞毒作用，在海马切片培养基中加入重组人类GDNF(rhGDNF)，1h后暴露于NMDA48h，在暴露前、后均可见到神经元死亡。通过检查发现，加入rhGDNF后，存活神经元数目显著增加，呈现明显的神经保护作用[4]。GDNF有抗凋亡作用，KitagawaH及AbeK等在局部应用GDNF的研究中发现，将大鼠的大脑中动脉永久性栓塞，GDNF减小了脑缺血后的梗塞面积，脑水肿也明显减轻，而DNA断裂情况及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶免疫阳性反应，也都有改善。局部应用GDNF，脑梗塞面积减小了48％（P＝0.01），脑水肿程度减少30％（P=0.01）。TUNEL和免疫染色显示的caspases-1、3阳性反应明显减弱。提示GDNF减小梗塞面积和脑水肿程度，可能与减少DNA断裂和凋亡信号有关，也有可能是通过caspases-1和caspases-3级联反应实现的[5,6]。鉴于GDNF具有强大的神经保护作用，目前的研究主要集中在基因治疗上。将外源性GDNF基因导入动物体内，然后检测GDNF的表达水平，观察其效果。但GDNF属生物大分子，不能直接通过血脑屏障，其应用受到了限制。作者拟用分子生物学及细胞生物学技术将大鼠GDNF基因转移到神经前体细胞或非神经细胞中，然后用于移植治疗实验性脑缺血，为脑缺血后神经保护基因治疗这一新思路进行尝试。本文报告第一部分工作，即大鼠GDNF基因真核细胞表达载体的构建及其鉴定。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种与质粒：大肠杆菌JM109、pMD18-TSimple平滑载体及质粒pEGFP-C1为ClonTech公司产品。1.1.2试剂：限制性内切酶、T4DNA连接酶、Klenow酶、TRIzol试剂、cDNA合成试剂盒、TagDNA、聚合酶X-gal及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶（IPTG）为TaKaRa公司产品。pEGFP-C1质粒购自ClonTech公司。1.1.3引物设计：CTS728F：5'ATAGATCTCGGGACTCTAAGATGAAGTT3'CTS728R：5'AAGGTACCCCAGGGTCAGATACATCCAC3'1.2方法1.2.1总RNA的提取:取约100mg的新鲜SD大鼠胎脑组织，加入1ml的RNA提取试剂TRIzol，充分匀浆后室温放置5分钟。加入200μl的氯仿充分振荡，室温放置2-3分钟。4℃12,000rpm/min离心10min，沉淀以70%的乙醇洗一次后抽干，溶解于50μlDEPC处理的水中，-70℃保存。以电泳和波长260nm光谱吸收的情况来判定所抽提RNA的质量和浓度。1.2.2GDNFcDNA的合成与PCR扩增反应：以TotalRNA为模板，OligodT-Adaptorprimer为反转录引物，使用TaKaRaRNALAPCRkit（AMV）Ver.1.1进行RT反应，合成cDNA。再以合成的cDNA为模板，CTS728F/CTS728R为引物，进行PCR扩增目的片段。取2μl反转录产物为模板；按常规的PCR反应条件，先将样品于94℃变性5min，加入2U的TaqDNA聚合酶，按下列参数循环35次：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，最后一个循环72℃反应10min。由于扩增片段量少，进行二次PCR扩增反应，取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片断，溶于15μldH2O。使用DNA连接试剂将InsertDNA与pMD18-TSimple平滑载体连接后，热转化至E.coliCompetentJM109Cell中，涂布平板后，37℃过夜培养。1.2.3挑选菌落，提取质粒后，测序：质粒CTS728-1、质粒CTS728-8以BcaBESTPrimerM13-47、BcaBESTPrimerRV-M为引物进行DNA测序。1.2.4GDNFcDNA真核表达载体的构建:pEGFP-C1质粒用Bg1II和KpnI双酶切，切胶回收InsertDNA载体。溶于15μl的dH2O中。质粒CTS728-8用Bg1II和KpnI双酶切，切胶回收InsertDNA片段。将载体和Insert片段连接，构建载体转基因重组质粒pEGFP-GDNF。热转化至E.coliCompetentDH5α中，涂布平板过夜培养。挑选菌落，提取质粒后，Bg1II和KpnI以10μl体系做双酶切检测，确认目的片段是否插入。酶切产物全量琼脂糖凝胶电泳。1.2.5SH-SY5Y细胞培养：培养基采用DMEM，10％胎牛血清，100U/ml青霉素和链霉素，于37℃，5％CO2孵箱中培养，2d换液一次。1.2.6GDNF工程细胞的制备：电转使用Eppendorf公司电转仪240伏，100ms'。转染后48小时加G418300μg/ml，72小时荧光显微镜观察。挑取阳性克隆扩增培养。2结果2.1大鼠GDNFcDNA的克隆实验中我们以TRIzol试剂来提取大鼠胎脑组织的总RNA，A260/A280为2.0，电泳分析清晰可见28S及18S两条核糖体RNA、说明抽提的总RNA无明显降解。根据schaar等报道的大鼠GDNF的全长cDNA序列，经微机分析，设计两个引物：引物1：5'ATAGATCTCGGGACTCTAAGATGAAGTT3'引物2：5'AAGGTACCCCAGGGTCAGATACATCCAC3'引物1为GDNF全长cDNA5'端的序列，引入Bg1II酶切位点，含启始密码子ATG。引物2为GDNF全长cDNA3'端序列的互补序列，引入KpnI酶切位点。以上述合成的cDNA为模板进行PCR扩增后得到一条约640bp的清晰条带。使用DNA连接试剂将InsertDNA与pMD18-TSimple平滑载体连接后，热转化至E.coliCompetentJM109Cell中，涂布平板后，37℃过夜培养。挑取两个阳性克隆质粒CTS728-1、质粒CTS728-8以BcaBESTPrimerM13-47、BcaBESTPrimerRV-M为引物分别进行测序，所测序列与文献报道的序列一致。2.2重组质粒pEGFP-GDNF的构建真核表达载体pEGFP-C1带有一突变的绿色荧光蛋白的cDNA告基因，能发出高亮度的绿色荧光，在荧光显微镜下能检测到载体的表达。将克隆在pMD18-TSimple平滑载体中的大鼠GDNF基因片段以Bg1II和KpnI双酶切，低熔点胶分离后与先经Bg1II和KpnI双酶切的真核表达载体PEGFP-C1相连接，构建在体转基因重组质粒pEGFP-GDNF（图1）。结论No.51617交流论坛交流论坛重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及SH-SY5Y细胞的转染摘要关键词目的采用RT-PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA，并克隆到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中，经酶切鉴定及测序分析对重组质粒pEGFP-GDNF作进一步鉴定。采用电转方法将重组质粒pEGFP-GDNF转染至SH-SY5Y细胞。胶质细胞源性神经营养因子/生物合成，逆转录-聚合酶链反应、遗传载体，重组，遗传，基因疗法，融合蛋白转染细胞构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因的真核细胞表达载体，为应用GDNF进行如帕金森综合症之类的神经元退化性疾病的基因治疗打基础。结果大鼠GDNFcDNA已正确地克隆到真核表达载体pEGFP-C1中，而构建成重组大鼠质粒pEGFP-GDNF。GDNF基因在细胞中可稳定表达。方法真核细胞表达载体pEGFP-GDNF以及表达GDNF工程细胞SH-SY5Y的成功构建，为进一步开展GDNF基因治疗脑缺血疾病的研究奠定了基础。胶质细胞源性神经营养因子（glialcellline-derivedneurotrophicgrowthfactor，GDNF）属于TGF-β超家族成员，最早由小鼠胶质细胞株B49细胞分离并命名。这种蛋白质具有很强的促多巴胺能神经元存活的作用。随着研究的深入，发现它具有广谱性神经营养作用[1,2]。它不仅作用于多巴胺神经元，而且对周围神经系统运动神经元和感觉神经元的发育，存活和再生有促进作用。在脑缺血的研究中，发现GDNF参与神经修复过程，并发挥神经保护作用。GDNF可以调节酪氨酸羟化酶的表达，有实验表明海马内注入GDNF后，降低了缺血诱发的THmRNA水平；海马局部用GDNF处理，也减少了TH样免疫阳性反应[3]。另外GDNF还有抗NMDA的细胞毒作用，在海马切片培养基中加入重组人类GDNF(rhGDNF)，1h后暴露于NMDA48h，在暴露前、后均可见到神经元死亡。通过检查发现，加入rhGDNF后，存活神经元数目显著增加，呈现明显的神经保护作用[4]。GDNF有抗凋亡作用，KitagawaH及AbeK等在局部应用GDNF的研究中发现，将大鼠的大脑中动脉永久性栓塞，GDNF减小了脑缺血后的梗塞面积，脑水肿也明显减轻，而DNA断裂情况及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶免疫阳性反应，也都有改善。局部应用GDNF，脑梗塞面积减小了48％（P＝0.01），脑水肿程度减少30％（P=0.01）。TUNEL和免疫染色显示的caspases-1、3阳性反应明显减弱。提示GDNF减小梗塞面积和脑水肿程度，可能与减少DNA断裂和凋亡信号有关，也有可能是通过caspases-1和caspases-3级联反应实现的[5,6]。鉴于GDNF具有强大的神经保护作用，目前的研究主要集中在基因治疗上。将外源性GDNF基因导入动物体内，然后检测GDNF的表达水平，观察其效果。但GDNF属生物大分子，不能直接通过血脑屏障，其应用受到了限制。作者拟用分子生物学及细胞生物学技术将大鼠GDNF基因转移到神经前体细胞或非神经细胞中，然后用于移植治疗实验性脑缺血，为脑缺血后神经保护基因治疗这一新思路进行尝试。本文报告第一部分工作，即大鼠GDNF基因真核细胞表达载体的构建及其鉴定。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种与质粒：大肠杆菌JM109、pMD18-TSimple平滑载体及质粒pEGFP-C1为ClonTech公司产品。1.1.2试剂：限制性内切酶、T4DNA连接酶、K