重组质粒pGEX

重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达赵巍1苏川2吴海玮2胡雪梅2沈蕾2王荣芝2马磊2陈淑贞SUP.2sup张兆松2【摘要】目的构建基因工程菌株，获得重组蛋白Sj-FABPc（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）。方法用PCR法从日本血吸虫cDNA文库中扩增Sj-FABPc基因片段，再将该片段重组于pGEM-T中并进行DNA测序鉴定.经酶切后将目的片段构建成重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc,转化于大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。用GlutathioneSepharoseTM4B亲和层析柱对表达产物进行纯化，PreScissionTMProtease酶对融合蛋白进行解离，获得纯化的14kDaSj-FABPc。SDS-PAGE和Westernblot方法对表达产物进行鉴定。结果获得pGEX-6P-1/Sj-FABPc菌株，分离纯化出14kDaSj-FABPc，表达量为10.52mg/L。Westernblot显示，表达蛋白能被日本血吸虫免疫兔血清识别。结论重组蛋白Sj-FABPc可高效表达并有良好的抗原性。【关键词】日本血吸虫；脂肪酸结合蛋白；基因克隆；重组抗原；融合表达CONSTRUCTIONOFRECOMBINANTpGEX-6P-1/Sj-FABPcANDEXPRESSIONINE.coliZhaowei1SuChuan2WuHaiwei2HuXuemei2ShenLei2ZhangZhaosong2etal1DepartmentofBiology,NingxiaMedicalCollege,Yinchuan7500042InstituteofMedicalMolecularBiology,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029【Abstract】ObjectiveToobtainrecombinantproteinSj-FABPcbygeneengineering.MethodsThegenefragmentofSj-FABPcwasamplifiedbyPCRfromtheadultwormcDNAlibraryofSchistosomajaponicumandthensubclonedintopGEM-Tvector.ThegenesequencewasidentifiedandthetargetfragmentwasrestrictedlydigestedandsubclonedintoexpressionvectorpGEX-6P-1.Theproteinisexpressedandcharacterized.ThefusionproteinwaspurifiedbychromatographyusingGlutathionSepharoseTM4BandwasdigestedbythePreScissionTMProtease.The14kDaSj-FABPccanbeobtained.TheantigenicityofrSj-FABPchasbeendemonstratedbyWesternBlot.ResultsThepGEX-6P-1/Sj-FABPcwasconstructedandexpressedasrSj-FABPcinE.coliBL21,theyieldofwhichwasaround10.52mg/L.TherSj-FABPccanberecognizedbytherabbitserumwithSchistosomajaponicuminfectionusingwesternblotting.ConclusionsTherecombinantfusionproteincouldbeexpressedefficientlyandhadgoodantigenicity.【Keywords】Schistosomajaponicum,Fattyacidbindingprotein(FABP),genecloning,Recombinantantigen,fusionexpression目前，血吸虫病防治的主要手段是采用吡喹酮进行化疗。但由于药物本身价格高，而且在一些反复化疗的再感染病人身上已经出现了抗药性的趋向，因此，近几年来利用基因工程的方法发展血吸虫病重组疫苗已成为血吸虫病综合防治的一项重要措施。脂肪酸是血吸虫重要的营养成分之一，血吸虫干重的三分之一由脂质组成。由于血吸虫自身不能合成长链脂肪酸和类固醇，必须利用其细胞膜中的脂肪酸结合蛋白（FABP）来吸收、运输和吞噬宿主的各种衍生脂肪酸。因此，FABP在血吸虫脂肪酸代谢中起着非常重要的作用[1]，也使它成为极具吸引力的疫苗候选分子。对曼氏血吸虫脂肪酸结合蛋白（Sm-14）的研究已显示出其具有很好的动物免疫保护性，并被WHO/TDR列为候选疫苗分子[2]。日本血吸虫病重组疫苗的研究也取得了很多进展，Becker[3]等从日本血吸虫（菲律宾株）cDNA文库中克隆出日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（Sj-FABPc）的基因片段，并进行了重组和表达。国内[4，5]对日本血吸虫（中国大陆株）FABPc进行了分子克隆和重组蛋白融合表达的研究。本研究用PCR的方法，从本室陈淑贞[6]等构建的日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库扩增出Sj-FABPc基因，又对该目的基因进行了分子克隆和高效诱导表达，并用亲和层析柱对Sj-FABPc进行了纯化及从融合蛋白中解离等内容的研究，试图通过以上的研究，为日本血吸虫病疫苗侯选分子FABP的研制和更深入的研究提供有价值的资料和物质条件。材料和方法1质粒、菌株和试剂表达质粒pGEX-6P-1及转化用大肠杆菌BL21、重组蛋白纯化系统购于Pharmacia公司。测序用质粒pGEM-T、限制性内切酶、T４连接酶、PCR试剂盒购于Promega公司。JM109菌株为本室保存菌种。2Sj-FABPc基因片段的PCR扩增2.1PCR模板的制备模板用本室构建的日本血吸虫中国大陆株江西地理株成虫cDNA库。该库构建于lgt11/Y1090系统，库容量为3.13´106，具体步骤按文献报道[6]。2.2PCR反应根据Becker发表的Sj-FABPc基因序列进行设计，引物I：5’AGAATTCATGTCTTCTTTCTTGGGAAA-3’，引物II：5’-TCGAGCGGCCGCACCAGTCTATCAGTTTGCAGG-3’，在两个引物的5’端分别设计了一个EcoRI和一个NotI酶切位点。PCR反应条件：92°C变性30s；55°C退火30s；72°C延伸30s，末次循环72°C延伸15min，总反应体积50ul。3PCR产物的核苷酸序列分析先将PCR产物亚克隆于pGEM-T载体，构建成重组质粒pGEM-T/Sj-FABPc，操作步骤按pGEM®-TVector试剂盒的要求进行，然后将重组体转化到大肠杆菌JM109中，用X-gal/Amp选择培养基挑选阳性克隆菌株进行目的片段的核苷酸序列测定（宝生物工程（大连）有限公司测定）。4重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc的构建和表达4.1目的片段和重组质粒的酶切及分子克隆：挑选含pGEM-T/Sj-FABPc的菌落进行培养，碱裂解法回收和纯化带有目的片段的质粒；同时取适量的表达载体pGEX-6P-1质粒，将二者分别用EcoRI和NotI进行双酶切处理，用1%的琼脂糖凝胶电泳分离带有双粘性末端的目的片段和表达质粒，并用玻璃珠吸附法[7]进行纯化，T4连接酶于15°C连接4h，构建成pGEX-6P-1/Sj-FABP（见图.1），并转化入BL21菌，用含Amp选择培养基筛选出阳性菌落。通过1%琼脂糖电泳对阳性菌中提取的质粒进行鉴定。4.2重组蛋白的诱导表达和鉴定：将已经鉴定的阳性菌落接在50mlYT培养基中,以37°C、240r/min条件下进行培养，等菌液浓度生长至OD600=0.5时加IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养5h，离心收集细菌进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。5融合蛋白的纯化和Sj-FABPc解离5.1融合蛋白的小量纯化：以50mlYT培养基来扩菌，同前述条件进行诱导表达，经离心收集培养菌并通过冻融法进行融菌裂解。将裂解液以10,000r/min离心10min，收集上清。用50ul柱床体积的GlutathioneSepharoseTM4B亲和层析柱与细菌裂解上清液混合,25°C吸附30min。经PBS冲洗后，加入洗脱缓冲液（含10mM还原型谷胱甘肽，50mMTris-HClpH8.0）将融合蛋白洗脱下来。取少量纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE,用血吸虫成虫抗原免疫兔血清和正常兔血清对表达融合蛋白进行Westernblot免疫印迹实验。5.2重组蛋白Sj-FABPc的解离：与上一步骤相同的是先用亲和层析柱吸附大肠杆菌裂解液，并用PBS冲洗。然后加入解离液（含2ul解离蛋白酶PreScissionTMProtease）将Sj-FABPc从融合蛋白中解离下来（详细操作步骤按蛋白纯化系统说明书）。取少量经解离而纯化的Sj-FABPc进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。图1重组质粒构建示意图Fig.1Constructionofrecombinantplasmid结果1PCR扩增结果用根据日本血吸虫菲律宾株FABP基因设计的引物，从Sj-cDNA库中扩增出一段440bp左右的DNA片段。结果见图.2。441bp→图.2目的片段的PCR扩增Fig.2PCR-amplifiedproductandidentificationoftherecombinantclonesa.PCRproductofSj-FABPc1.PCRproduct2.DNAmarker(фx174-HaeⅢdigest)2目的DNA的核苷酸序列分析测序结果表明目的片段由441bp组成，其中编码基因由399bp组成，编码133个氨基酸。对照Becker发表的序列,本实验重组于pGEX-6P-1载体中的目的片段确定为Sj-FABPc。共进行了两次核苷酸序列分析，其结果完全一致。3重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc的鉴定挑选阳性菌落,对重组质粒进行提取和电泳鉴定。确定的阳性克隆菌经IPTG诱导表达后SDS-PAGE的结果显示，40kDa处有一明显的染色条带，带有空载质粒的阴性对照可见载体本身表达的日本血吸虫26kDaGST，而不带质粒的阴性对照则两个条带均无（见图.3），初步确定40kDa处的蛋白分子为Sj-FABPc/GST融合蛋白。40KDfusionprotein→26KDGST→图.3重组蛋白的SDS-PAGE鉴定Fig.3SDS-PAGEofrSj-FABPc1.E.coliBL212.pGEX-6P-1/BL213.pGEX-6P-1/Sj-FABPc/BL214.proteinmarker4重组Sj-FABPc的纯化和解离经亲和层析柱纯化和PreScissionTMProtease解离后，分别获得了纯化的40kDa融合蛋白和解离下来的14kDaSj-FABPa，SDS-PAGE结果显示如图.4，Westernblot显示Sj-FABPc能够被日本血吸虫免疫兔血清识别（见图.5）。经MolecularAnalystsoftware软件（BIO-RAD公司出品）定量计算分析显示该阳性菌株的融合蛋白表达量为33.3mg/L。40KD→26KD→14KD→图.4SDS-PAGE鉴定纯化Sj-FABPcFig.4SDS-PAGEofpurifiedrSj-FABPc1.pGEX-6P-12.pGEX-6P-1/Sj-FABPc3.Sj-FABPc4.proteinmarker←40KD←26KD←14KD图.5Westernblot对重组Sj-FABPc的识别Fig.5WesternblotanalysisofpurifiedrSj-FABPcM.proteinmarker1.Sj-FABPc2.pG