重组质粒构建

DNA重组质粒的构建医学生物所病毒免疫室基因克隆genecloning应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。核心技术：DNA重组技术（recombinantDNAtechnique）基因克隆的基本程序：分—切—接—转—筛PCR酶切连接转化&转染抗性或标记筛选目的基因DNA片段的获得外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞重组DNA分子克隆的筛选和鉴定目的基因或其表达产物的纯化和鉴定基因克隆技术的特点：1.可在体外人工的,有目的的,根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复；2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。基因克隆示意图载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因＋重组体宿主细胞＋已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体例：干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是：从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来产生干扰素。酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低。DNA重组操作过程载体外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞abbA重组Ab抗性筛选重组筛选重组质粒构建：目的DNA的PCR扩增DNA片段和载体的酶切片段DNA与载体的连接载体：plasmid（primary）工具酶：限制性内切酶连接酶常见的基因工程载体载体：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的运载工具。根据来源：plasmid;phage;viral;BAC;YAC根据用途分：克隆载体；原核生物表达载体；真核生物表达载体根据与宿主的关系分：整合性载体、非整合性载体基因工程中用得最多的是plasmid载体。下面介绍几种常见的载体。载体的基本结构单元：1.复制起点2.克隆位点3.筛选标记其他条件：4.适当大小5.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。质粒(Plasmid)质粒是独立于宿主细胞（如细菌）染色体之外的可进行复制和遗传的遗传单位-双链闭合环状超螺旋DNA分子。是一种环状的双链DNA分子，大小从1K-200Kb。通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。质粒DNA的特征质粒复制依赖宿主细胞的复制机器，但可以独立复制。（单拷贝或多拷贝：紧密型质粒和松弛型质粒）严紧型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质，可以在细菌间转移与丢失。质粒可自行失去或经人工处理而消失可有几种质粒同时共存在于一个细菌内，但同群质粒有不相容性（同群质粒具有同源性，可以产生相同的阻遏蛋白，故彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞）（四）人工构建质粒的基本元件启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复制抗性基因：用于筛选阳性克隆。多克隆位点：插入外源基因。对于表达载体还需要启动子、多聚A尾等.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。pBR322plasmid是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备：复制起点:Ori克隆位点:EcoRI;HindIII;BamHI;SalI筛选标记:Ampr。T-vectorPCR产物亚克隆载体T—Vector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性,所以用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。T-vector克隆PCR产物时用高效连接液LigationSolutionI可以在极短的时间内(30分钟～1小时)完成连接反应，大大地方便了实验操作。用途克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物使用M13primers进行DNA测序。原核生物表达载体Bacterialexpressionvector复制起点克隆位点筛选标记启动子﹡转录终止序列﹡核糖体结和位点：起始密码子ATG和SD序列（翻译识别）原核生物表达载体的基本结构单元包括：真核生物表达载体（mammalianexpressionvector)真核生物表达载体的结构单元复制起点（真核和原核）克隆位点筛选标记(原核和真核标记）增强子/启动子﹡PolyA﹡终止信号LocationofFeaturesPCMVIE:CMVIEenhancer:1-659CMVIEpromoter:669-750Interveningsequence(IVS):890-1022T7RNApolymerasepromoter:1067-1085Multiplecloningsite:1085-1137T3RNApolymerasepromoter:1158-1137SV40fragmentcontainingpolyadenylationsignal:1167-1388f1originofreplication:1483-1938EGFPexpressioncassette:2002-3455SV40enhancer/earlypromoter:2002-2420EGFPstructuralgene:2449-3168Kozakconsensustranslationinitiationsite:2442-2452Startcodon(ATG):2449-2451;Stopcodon:3166-3168InsertionofValatposition2:2452-2454GFPmut1chromophoremutations(Phe-64toLeu;Ser-65toThr):2731-2735His-231toLeumutation(A--T):3143Bovinegrowthhormone(BGH)genefragmentcontainingpolyadenylationsignal:3182-3455SV40originofreplication:2318Ampicillinresistance(b-lactamase)gene:3449-4709Startcodon(ATG):3849-3451Stopcodon(TAA):4707-4709噬菌体载体λ噬菌体(λphage)外源DNA：9~23kb常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列粘性质粒(cosmid)：λDNA的cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kbM13噬菌体λ噬菌体(λphage)特点：一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型为双链线状DNA分子，长度48.5kb,分子两端各有一个12bp组成的粘性末端,感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环,连接处称COS位点。1.本身有复制体系;2.中间(J-N间)是λ生长非必需区,可被其它外源DNA取代;3.λDNA在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高;4.载体容量大,可装入大片段外源DNA(20kb);5.可人工加入多克隆位点;6.筛选容易——噬菌斑筛选;7.主要用于DNA文库构建.插入型载体——含单一的限制性酶切位点，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文库构建；取代型载体——含某一限制性酶的两个切点，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因组DNA文库构建。粘性质粒(cosmid)是一种人工改造的载体,双链环状DNA，含有λDNA的cos区+质粒，克隆容量：40~50kb1.λ-DNA的COS位点;2.质粒的复制起点和抗药性标记(Ampr);3.多种单一的酶切位点.cosmid较小,约4–6kb,可容纳40-45kb的外源DNA,由于噬菌体DNA包装时包装蛋白识别的只是DNA粘性末端附近的一小段顺序，因此只要一个质粒接上此粘性末端顺序，再加上外源DNA片段使其长度为野生型DNA大小的75－105%，重组体可象噬菌体一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选.优缺点:1.克隆效率高;2.可利用质粒DNA的方式扩增;3.可克隆较大DNA片段;主要用于真核基因的克隆,基因组文库构建4.缺点:产生串联现象。M13噬菌体一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb,感染大肠杆菌后,ssDNA转变为dsDNA,可用作克隆载体.最大优点：产生单链DNA,可制备单链DNA探针.构建基因文库的克隆载体粘粒(Cosmid)细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体(YAC)P1噬菌体人工染色体(PAC)P1及YAC载体酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色体的着丝粒和自主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒的Tel序列，选择性标志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。一个典型的YAC系列载体病毒载体DNA病毒在细胞中具有较高的拷贝数，并有较强的启动子，因而是基因工程载体的理想候选者。诸如：SV40（猴肾病毒）Epstein-Barr病毒(EBV病毒)牛乳头瘤病毒（BPV）昆虫杆状病毒（baculovirus)由于存在容量小、宿主范围小等缺陷，天然SV40病毒作为载体很少被使用，多数载体为带有来自SV40中转录元件的质粒型载体·SV40增强子、启动子和复制子，可以在哺乳动物细胞中产生高效的组成型表达。·SV40polyA信号，可以对转录产物进行加工，稳定转录产物的活性。·Zeocin抗性基因，可作为大肠杆菌及哺乳动物细胞的选择标记。Zeocin抗性基因在大肠杆菌中的合成由EM-7启动子控制，在哺乳动物细胞中的表达由CMV启动子控制，既可用于瞬时表达，也可用于筛选稳定表达的细胞系。·f1复制子，可产生单链DNA。·ColE1复制起始位点，使质粒可在大肠杆菌中复制扩增。EB病毒EB病毒Epstein-Barr病毒(EBV病毒)是人类疱疹病毒,可转化人的B淋巴细胞，在转化细胞中以染色体外附加体形式存在。EBV病毒的顺式作用因子oriP可以在带有EBVDNA并表达具有反式作用的EBNA－1抗原的贴壁细胞中维持附加体DNA分子的存在，因而能作为构建表达载体的元件，该类载体也主要用于建立带有多拷贝外源基因的细胞系。可在多种细胞中表达，可表达基因组DNA和cDNA,可为表达细胞系。ComparisonofdifferentcloningvectorsVectortypeLengthofclonedDNAPlasmid20kbPha