第六章32P示踪技术

第六章32P示踪技术§6-1示踪剂及标记方法•一、产品制剂•1．能量、半衰期：•射线能量大，1.7112Mev，测量方便，但使用时要注意防护。•半衰期较短，T1/2=14.3天，便于废物处理。•（33P，Emax=0.249Mev，T1/2=25.3天，在电镜自显影和分子生物学等领域应用较多，在后面介绍。）•2．产品形态：•①有载体和无载体的磷酸盐：•如：32P-K2HPO4、32P-KH2PO4、32P-Na2HPO4、32P-NaH2PO4。•②口服液：磷[32P]酸钠。•③注射液：磷[32P]酸钠、胶体磷[32P]酸铬注射液。•二、标记方法•1．肥料标记：（核农学P-320）•⑴合成法：•①把32P结合到其中一种成分中去。如可在制备过磷酸钙时，在硫酸中加入32P标记的磷酸盐，用这种硫酸处理磷矿粉，制得的过磷酸钙，除有正常结构外，还有分布均匀的32P示踪原子。•32P-磷酸盐+硫酸→处理磷酸粉→32P-标记过磷酸钙•②实验室内用32P-H3PO4制备标记磷酸铵•H332PO4+NH3=NH4H232PO4•或H332PO4+2NH3=(NH4)2H32PO4•⑵交换法：•最常用的标记方法。用32P标记的磷酸盐溶液与普通过磷酸钙肥料混合，搅成糊状，保持若干小时，在此过程中不断搅拌，甚至可以加温至70℃左右，以促进肥料中的31P与加入的32P进行同位素交换，直到达到相对平衡，然后烘干，磨细备用。•⑶中子活化法：•标记难容性矿粉时，用同位素交换法，其速度极为缓慢。•可直接把磷矿粉放入原子反应堆中，用中子轰击磷矿粉的方法（中子通量一般不低于1012~13n/cm2·sec），使磷矿粉中的31P获得中子后变为32P（31P+δn—→32P+r）。•这种比较方法可使磷矿粉中的其它元素同时被标记，在使用前需将短半衰期的放射性核素进行冷却衰变，在操作及样本测量时，也需要注意其它被活化的放射性核素，如45Ca、46Sc、60Co等放射性的防护和叠加干扰。•冷却(Cooling)：通过放射性衰变来减弱强放材料的放射性活度的方法。•2．土壤标记：•将32P标记液注射或喷洒到土壤中，或与土壤均匀混合。可用于测定肥料利用率、磁带土壤有效养分、研究土壤中根条活力、根际磷吸收、耗竭等。•3．植物标记：•⑴根部引入，用土培、水培或砂培等。•⑵地上部分引入：叶面喷涂、茎根注射。•主要用于研究植物对磷的吸收、运转和代谢等。•4．离体标记：•研究磷的运转、代谢等。•5．其他：•微生物标记通过培养介质标记，单细胞藻类也可通过培养介质标记。如将32P-K2HPO4加到培养钝顶螺旋藻的培养液中，可得到32P-钝顶螺旋藻体，进而可用标记的藻体用作鱼饵料的研究和珍珠蚌摄食的研究。（核农学通报：1987，2：7－8）•§6-232P样品的制备和测量•一、活体样和鲜样：•可以把活体测量看作是测量固体样品的特殊方式。例如，在研究32P标记的肥料自土壤进入植物体的速度时，即要进行活体测量。可用钟罩型计数管进行植物活体测量。活体测量虽然简单易行，但误差很大，一般只能粗略的定性测定。•新鲜样品的策略是把新鲜样品采回，稍许加工，不进行灰化。或烘干即进行测量。主要有“打孔法”和“匀浆法”。（见农学中同位素示踪技术P-122）。上述鲜样组织的测样，虽然手续简便、迅速，但误差很大。一般仅能判断同位素在各组织器官中大致的放射性活度。•二、干样：•粉样：50~100mg/皿，无限薄、均匀。•三、湿灰化：•1．HClO4－H2O2法，慢灰化、起泡法。•2．H2SO4－H2O2法，消煮•葛才林等。小麦干粉0.5g，加Na2H32PO4，加3mlHClO4和3mlH2O2，加热起爆至无色，碱液稀释到10ml，闪烁测量。•四、干灰化：•500~550℃马福炉中灰化4~5h，至灰白色，用2NHNO3溶解，蒸发至半干，过滤定容。•测量方法：定标器、契伦可夫、液体闪烁测量等。•§6-3植物对磷的吸收利用和代谢研究•一、植物体内32P代谢组分的提取和分离：•见实验资料。陈子元主编，核技术及其农业科学中的应用，P518~519。•二、磷的吸收、运转研究：•1．磷的吸收、运转和小麦生长发育的关系•王志芬等，核农学通报，93，14（4）：171~179。•2．磷在棉株中的吸收、运转和分布规律•许萱等。•3．磷素代谢研究•离体小麦根和叶中32P的转化。（P520~521陈子元，核技术及及其农业科学中的应用）•§6-4磷肥利用的研究•一、原理：•1．利用标记磷肥：•根据同位素稀释原理：Pf×Sf=PT×SP=Pf/PT=SP/Sf•Pf：植物中吸收自肥料的磷含量；PT：植物体内的总磷；SP：植物中比活度；Sf：肥料中比活度。•Pf/PT为植物吸收的肥料磷占植物中总磷的比值，简称Pdff，则吸自土壤P的比值为1-Pdff。•磷肥利用率（%）=植物吸收肥料P2O5（mg）/应用的肥料P2O5（mg）×100•=（Pdff×PT/应用的肥料P2O5）×100•2．利用标记土壤：•将标记的磷酸盐与土壤充分拌匀，使土壤磷获得标记，然后在这种标记突然施入未标记的磷肥，以不施磷肥的对照。种植作物，收获后，植物材料烘干、消化（或灰化），测总P和32P活度。按下式计算磷肥利用率：•PE=Pf/f=（P-PS）/f=1/f(P-Pe×r’/re’)•Pf：吸自肥料的磷；f：施用的肥料磷；PS：吸自土壤的磷；r’：为施磷肥植株32P放射性活度；re’：为不施磷肥处理植株32P放射性活度；Pe：不施磷肥处理植株吸磷量。•二、实例：•１．各种矿质磷有效性的直接评价•R.D.Armstrong等（plant&Soil.993,150:279~287）•酸性土壤中，磷形态：铁铝盐，无定形：Fe-P,Al-P•结晶形：Fe:Strengite;Al:Variscite•这四种形态P，由人工合成，用中子照射均匀标记，以强烈搅拌的悬浮液加到盆钵中。•水溶性P：KH2PO4+无载体H332PO4与土壤混合，土壤充分干燥后，加水至田间持水量，种植玉米。•①各种形态P的回收；②植株中Pdff；③植物中P比活度（14~18天），以KH2PO4为100。•Al-PFe-PStrengiteVarisciteKH2PO4•40-5319.3-38.91.1-1.92.6-3.4100•２．配施水溶性磷肥（重过磷酸钙，TSP）对增加磷矿粉中磷的有效性的效应。（S.H.Chienetal.SoilSci.Sol.Am.J..60:1173~1177）•配施TSP增加玉米和cowpea（缸豆）对磷矿粉的吸收利用效率。•⑴处理：•①soil+PR：用32P-KH2PO4标记土壤，1ml32P→5LK2HPO4（20mg/L），取80ml→4kg土，1wk后，施用PR。•②soil+TSP：标记TSP（用交换法）•③soil+TSP（labeled）+PR，其中TSP：PR=50：55•在各处理中种植玉米和缸豆。•⑵采样：42天收地上玉米，45天收cowpea，烘干，粉碎，用HNO3和HClO4混合液消化，测消化液中P浓度，闪烁测量32P。•⑶计算：•①soil+PR：植物从磷矿粉吸收的P的量：•PdfR=1－Pdfs=1－[SA(PR+soil)/SA(soil)]…………….…①•PPR=PdfR×Psoil+PR……………………...……………………②•②soil+TSP：•PdfT=SA(TSP+soil)/SA(TSP)……..…….…………………③•PTSP=PdfT×P(TSP+soil)………….……………………………④•Psoil(TSP)=P(soil+TSP)－PTSP……………..….…..………………⑤•③TSP+PR+soil（标记TSP）：•PdfT(PR)=SA(PR+TSP+soil)/SA(TSP)……….….…………⑥•PPTS(PR)=PdfT(PR)×P(PR+TSP+soil)……………….….…………⑦•PPR+soil(TSP)=P(PR+TSP+soil)-PTSP(PR)………….……..…………⑧•PPR(TSP)=PPR+soil(TSP)-Psoil(PR+TSP)………..…………..……⑨•假定Psoil（TSP+PR）=Psoil（TSP），则⑨式可求。•（因为研究表明，在有TSP时，加本试验矿添加的PR，对植物吸收土壤中的P无大影响。）•比较PR单独施用时和配施TSP时，植物对PR中P的吸收，结果由于配施TSP，使玉米和cowpea对PR-P的吸收分别增加了3.48mg和1.38mg每盆，相对增加165%和72%。•§6-5同位素示踪法测定有效磷•土壤中的养分，并不是均对植物有效，为了衡量土壤中有效养分，即土壤肥力，或供应养分的能力，最早是用作物对施肥的反应来估测的。常规的化学提取法虽然能测定土壤固体表面吸附的养分量，但提取并不是专一的，而且在抽提过程中可能会引起养分形态的变化。采用同位素法不仅可测定土壤中可交换养分量，而且根据植物吸收来评价土壤中有效养分的量。用来平衡同位素的系统不同，测定的有效养分可分为E、L和A值。都以典型的同位素稀释公式来计算：•E、L和A值=S1X/S2－X=X[(S1/S2)－1]•式中X为加入系统中示踪剂的量；S1和S2分别为平衡前后同位素的比活度。•一、测定原理：•1．E-值：（核农学P-313）•土壤加水或0.01MCaCl2，组成悬浮液，加入32P-磷酸盐，溶液中32P与土壤颗粒表面的31P会发生同位素交换反应：•31P表+32P溶=32P表+31P溶•达到平衡时，固体表面和溶液中的32P比活度相等。即：•32P表/31P表=32P溶/31P溶……………………..…………①•则31P表=32P表×31P溶/32P溶……………………………②•用这种同位素交换法测得的31P表，McAuliffe等称为表面磷.•Russell等提出有效磷概念，即为表面磷加溶液磷，代表系统中能为同位素交换的或能进行同位素稀释的这部分磷，称为E-值。•由于E-值与平衡时间有关，故又用Et表示。根据Et的概念，可交换P(Et)应为表面P与溶液P之和，所以：•Et=31P表+31P溶=31P溶×32P表/32P溶+31P溶•=31P溶[(32P表/32P溶+1)]=31P溶[(32P表+32P溶)/32P溶]•其中，Sf为平衡时溶液32P的比活度（即：Sf=32P溶/31P溶）。•如果土壤固磷能力很强，或土壤有效P含量很低时，须加入载体，采用载体法。这时，②式中的Et须减去加入的磷。•Et=32Pi/Sf－31Pi=Si×31Pi/Sf－31Pi=31Pi(Si/Sf－1）……………③•其中Si=32Pi/31Pi为所加示踪剂的比活度。（32Pi为最初加入的32P）31P溶×32Pi/32P溶=32P/Sf…②32P表+32P溶=32Pi•因由土壤吸附的磷酸盐保持可交换的状态，所以加到平衡溶液中的磷的量对E-值没有影响，也即用载体32P和用无载体32P得到的结果一致。•但如土壤中具有强亲和力的化合物时，以无载体法加到土壤的32P与这些化合物作用，而被土壤吸附或固定不再参与同位素交换，因而引起32P的损失，而使测定值过高。•如果采用载体法，由于32P只占31P的很少部分，则由于固定或吸附所引起的损失可忽略不计，因而能正确地反映土壤中可交换磷的量。•但如果加到土壤中的磷比可交换磷的量大得多，则稀释前后的比活度差别很小，而使灵敏度降低。•用无载体法还是有载体法，以及载体法所加载体的量依土壤上固磷能力的大小来决定。•试验表明，固定能力低的土壤，示踪剂的损失可忽略不计，故可用载体法；中等固定能力的土壤，无载体法显示示踪剂的损失，这种情况下，采用载体法，损失可忽略不计。而对于高磷能力的土壤，即使用载体法，也不可避免32P的损失。所以测定可交换磷必须用二种方法进行比较，如获得同样的结果，表明无载体法的结果可靠。•Fathi等提议的载体法，是1g土用0.2mg/L的磷酸盐溶液平衡30’；而M.Frie