国家自然科学基金标书范文3

国家自然科学基金申请书2011版第5页申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；4、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。查看报告正文撰写提纲报告正文面上项目申请书撰写提纲（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1.项目的立项依据（1）老龄心肌缺血/再灌注（IR）损伤与缺血预适应（IPC）保护人口老龄化是当今世界一个突出性的社会问题，我国人口老龄化发展速度尤其之快。提高老年人的生活质量，已经成为全社会研究的重要课题。冠心病是引起老年人死亡的最常见原因，其基本病理生理过程是心肌缺血，尽早恢复缺血心肌的血液供应能够挽救缺血心肌，但再灌注引起缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusioninjury,IRI）。缺血预适应（ischemicpreconditioning,IPC）是心肌保护的新概念，是迄今为止最强的内源性心肌缺血保护方法。但由于老龄心肌细胞发生退行性变，心肌细胞自噬能力降低，线粒体功能下降（mtDNA突变），氧化应激增强，老龄导致内源性保护物质的生成减少以及IR损伤中发重要作用的蛋白质（膜受体、下游的激酶、磷酸酶、促炎细胞因子等）表达/活性发生改变等，导致老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性减弱或消失【1,2】。因此，迫切需要有效的措施改善或恢复老龄心肌对缺血预适应刺激的敏感性，提高老龄心肌抗缺血损伤的能力，进而提高老年人的生存率。（2）多胺代谢带有多价正电荷的小分子多胺（polyamine,PAs）包括精胺（spermine,SP）,精脒（spermidine,SPD）及腐胺（putrescine,PU），广泛存在于迄今人们所研究的所有真核国家自然科学基金申请书2011版第6页细胞和原核细胞内，为细胞的生长、分化和增殖所必需，并在许多病理过程中发挥重要作用【3】。目前，小分子多胺作为一种内源性信号分子，已成为国际研究的热点【3-24】。生物体内多胺水平受精确调控。鸟氨酸脱羧酶（ornithinedecarboxylase,ODC）和精脒/精胺乙酰转移酶（spermidine/spermineN1-acetyltransferase,SSAT）分别为多胺合成与分解代谢的限速酶。ODC催化鸟氨酸脱羧生成腐胺，腐胺连接到S-腺苷甲硫氨酸上，在S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosylmethioninedecarboxylase,SAMDC）的催化下脱羧生成精脒，精脒通过精胺合成酶催化产生精胺。ODC可被多种生长因子、原癌基因、肿瘤促进剂和应激刺激等激活【4,5】；SSAT催化多胺的逆转化分解代谢，依次催化精胺转化为精脒，精脒转化为精胺。此分解反应过程中产生两种有毒代谢副产物3-氨基丙醛和过氧化氢（H2O2），因此，SSAT过度激活（多胺分解代谢增强）引起组织细胞损伤【6】。（3）多胺的生物学作用多胺具有广泛的生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、调控线粒体通透转运（MPT）、调控离子通道、促细胞增殖及在细胞内信号转导中发挥重要作用等【7-15】。文献报道，连续3天给小鼠腹腔注射精胺(10mg/kg)能明显抑制内毒素诱导的血清中炎症介质的释放【7】；多胺可抑制幅射等所引起的DNA损伤和脂质过氧化。活性氧可导致DNA断裂和/或硷基修饰，发生程序性细胞死亡，天然多胺含有类似叠氮钠(单线态氧淬灭剂)的氨基而发挥保护作用【8】；多胺可通过与细胞内带负电荷的生物大分子如核酸及蛋白质等结合稳定染色质、核酶、核酸和/或细胞膜。在分离的肝脏线粒体，精胺通过清除羟自由基，维持谷胱苷肽和巯基的还原状态，抑制线粒体通透转运孔（mPTP()开放【9】。在小鼠WEH1231B细胞和人的T细胞，多胺合成抑制剂引起线粒体膜电位（△ψm）下降和caspase-3激活，外源性多胺可逆转之【10】；细胞内精胺负责内向整流钾通道（irK1）的固有门控和整流特性，精胺通过调控谷氨酸盐受体的某些亚型，影响神经系统神经元和神经胶质细胞的兴奋性和Ca2＋的内流【11】；多胺可直接激活TPK和MAPK，促进原癌基因c-myc,c-jun和c-fos的表达【12】。RTK，PI3K和PKC抑制剂均能抑制生长因子诱导的ODC的磷酸化【13】。多胺为生长过程所必需，但过度产生也常伴有致癌和致组织细胞损伤作用【14,15】。随年龄增加哺乳类动物组织器官多胺水平降低（肝、肾、骨骼肌、心脏、肺等）,多胺合成限速酶ODC也呈相同下降趋势【16】。在老龄的组织细胞，激素诱导ODC激活的能力也明显降低【17】；健康人血清及尿液中多胺水平也随年龄增加而降低【18】。目前已知，国家自然科学基金申请书2011版第7页多种食物中富含多胺包括蔬菜、水果、鱼、肉、蛋、奶以及发酵食物如奶酪等，摄食富含多胺的食物对老年人的健康有益【19】。动物实验也证明，小鼠长期摄食富含多胺的食物，能明显降低老化相关的疾病，如肾小球硬化、动脉硬化，降低死亡率【20,21】。最新研究显示（2009,2010年文献），多胺可通过诱导细胞自噬延长生物体的寿命，具有抗衰老作用【22-24】。Morselli的研究显示，精脒能够诱导培养的酵母、线虫、果蝇、小鼠细胞及人的肿瘤细胞自噬，敲除或沉默重要的自噬相关基因（如atg-7，bec-1）取消了精脒延长寿命的作用；小鼠的饮水中加入多胺，也能显著减少衰老引起的氧化应激和细胞坏死【23】。Eisenberg证明精脒延长寿命的机制是通过抑制组蛋白乙酰转移酶使组蛋白去乙酰化，进而转录激活自噬相关基因atg7,atg11和atg15,诱导细胞自噬【24】。（4）衰老心肌自噬能力下降及其影响的下游事件自噬是存在于真核细胞中的生命现象，通过自噬清出细胞内受损的蛋白质和细胞器，维持细胞内稳态，对生物体正常发育及防治老化有积极的作用。分子水平上的研究发现，调节自噬和调节衰老的信号通路之间存在相互联系【25】。研究显示，随着年龄增加心肌细胞自噬能力明显降低，导致变性的蛋白质和损伤的细胞器不能有效被清除,细胞稳态发生变化【26】。衰老心肌线粒体自噬减少导致线粒体功能异常，表现为线粒体数目减少，体积增大，呼吸链上的各种酶复合体活性下降，呼吸链电子传递功能障碍，能量代谢障碍。线粒体功能异常导致呼吸链电子漏出ROS产生增加、线粒体DNA发生突变、蛋白质交联、巯基氧化、DNA甲基化下降、组蛋白乙酰化失控和生物膜脂质过氧化，造成大量的变性蛋白质和受损细胞器堆积在细胞内【27】。线粒体损伤使线粒体膜电位降低，线粒体发生通透性转运，cytc及凋亡诱导因子（AIF）释放入胞浆，引起细胞凋亡。近年来研究发现，自噬可通过清除受损的线粒体延迟和对抗凋亡【28】。在营养缺乏的情况下，少量线粒体通透转运孔（mPTP）开放，启动细胞自噬清除受损的线粒体，对细胞有保护作用。损伤严重时，大量的线粒体mPTP开放，cytc和AIP等释放入胞浆，激活凋亡程序。Xue等学者应用自噬抑制剂或基因沉默等手段证明自噬的发生早于凋亡【29】。Yan在猪慢性心肌缺血的实验中证实，自噬能够抑制慢性缺血引起的细胞凋亡，减轻缺血性心肌损伤【30】。Tracy的研究也显示线粒体损伤和mPTP开放是低氧诱导自噬的关键因子，能够促进营养缺乏状态下自噬体的形成,有利于细胞存活【31】。因此提示：衰老的心肌细胞→自噬能力下降→老化和受损的线粒体堆积→氧自由基产生增加→mPTP开放数目国家自然科学基金申请书2011版第8页增加→细胞凋亡。这可能是老龄心肌丧失缺血预适应保护作用的重要机制。小分子多胺在这一级联反应中发挥怎样的作用?还不清楚？(5)国内外研究现状及我们的工作基础从文献检索看，关于多胺的研究，国内外差距较大。表现在国内发表的论文数量少,主要涉及肿瘤诊断及癫痫、胃炎等多胺含量测定【32-34】，个别涉及细胞凋亡相关基因克隆、多胺代谢等【35】。多胺与心血管系统的关系少见报道（仅见于我们自己发表的文章，见作者代表作）。国外的大部分研究主要集中在多胺与肿瘤和脑损伤的关系，小部分涉及肠、肝、肺、肾等器官[36]。多胺在心肌的作用主要集中在多胺与心肌肥大的关系涉及心肌缺血的较少。Woodcock等报道到，大鼠心肌缺血/再灌注引起IP3释放伴再灌注性心律失常发生，庆大霉素和精胺(5mM)有效抑制之【37】。Ventura等的研究发现，精胺可诱导电刺激大鼠心脏发生负性肌力作用伴[Ca2+]i短暂降低，无刺激则不改变静息状态下的[Ca2+]i【38】。我们自己最的系列研究显示，多胺在成年大鼠心肌IR损伤及IPC保护中发挥重要作用【39,40】。但关于多胺在老龄缺血心肌的作用，国内外均未见报道。因此，多胺在老龄心血管系统中的生理作用和病理意义有待研究。前期我们在国家自然科学基金课题的资助下（NO.30770878，2007-2010，本人为课题主持人）在离体灌流成年大鼠心脏上首次发现，IPC处理能够上调成年大鼠心肌的多胺合成代谢（多胺合成限速酶ODC表达增加，总多胺池增加），给予ODC特异性抑制剂α-difluoromethylornithine(DFMO)取消了IPC介导的心肌保护作用，证明多胺是介导IPC心肌保护作用的内源性信号分子（见后面工作基础）；进一步证明IPC诱导的ODC/多胺通路上调主要与PKC、Erk1/2、PI3K/Akt信号转导通路的激活有关【39】。文章发表在MolCellBiochem.2009(332)135–144上。之前我们的另一项国家自然科学基金资助课题(NO.30470688，2005—2007,本课题申请人为第二完成人）的研究发现,缺血/再灌注(IR)损伤心肌多胺代谢失衡，腐胺增加，精脒、精胺减少总多胺池耗竭。外源性精胺(1mmol/L)能补充细胞内的多胺池，并通过下调死亡受体通路、抑制线粒体凋亡通路、清除自由基、抑制细胞内钙超载发挥心肌保护作用【40】。文章发表在EuropeanJournalof国家自然科学基金申请书2011版第9页Pharmacology2007,（562）236–246.上（见后面工作基础）。（6）本课题关注的问题基于我们前期的研究发现及文献报道心肌组织中的多胺随年龄增加而减少，多胺具有诱导细胞自噬、抗炎、抗氧化清除自由基、抗凋亡、调节线粒体钙缓冲以及多胺在细胞内信号转导中发挥重要作用等独特的生物学功能。我们提出：“外源性多胺可能恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性”。预实验结果初步证实了我们的推测。我们在离体心脏灌流模型上观察到，老龄大鼠心脏在离体灌流前慢性给予外源性多胺（多胺灌胃6周，参照文献给药量【20】），多胺恢复了老龄心肌对IPC刺激的敏感性（心脏功能有明显改善，冠脉流出液中LDH水平有明显降低），多胺合成限速酶ODC特异性抑制剂DFMO取消了这种改变（实验数据见后面的研究工作基础）。但关于老龄IR与IPC心肌多胺代谢的特点和规律如何？外源性多胺能否恢复老龄心肌对IPC刺激的敏感性？如果能，其机制是什么？以及多胺在老龄IPC心肌保护中作用的准确效应靶点是什么？这些还不清楚，这些是本课题研究的主要内容。本课题将在原有工作基础上，在器官、细胞及分子水平上观察青年与老年IR与IPC心肌多胺代谢变化的规律和特点，探讨老龄心肌IR损伤及IPC保护和多胺水平变化的内在联系。观察外源性多胺对老龄IPC心肌细胞自噬、线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的影响。通过诱导或阻断自噬（siRNA干扰）和调控线粒体通透转运（开放或抑制mPTP）干预，探讨外源性多胺是否通过诱导自噬/减少线粒体损伤/抑制氧化应激/抗凋亡级联重现老龄心肌IPC保护作用。并进一步细胞、亚细胞水平上探讨多胺发挥作用的准确效应靶点。以上问题的解决将能够验证我们提出的“多胺是介导缺血预适应心肌保护的内源性信号分子、多胺代谢通路可能成为老年心肌缺血/再灌注损伤防治的新靶点”的假说。目前，国内外未见相关