实验室常用载体介绍(Gateway技术)

实验室常用载体介绍载体构建的基本原理1.TA克隆(T4连接酶)Promega的T-easy载体（pGEM-TEasy）TAKRAT载体(pMD18-T)2.TOPOTA克隆(pCR8/GW/TOPO)定向克隆(pENTR)3.酶切连接实验室常用4.Gateway技术TOPO异构酶•Gateway®技术基于清楚了解的λ噬菌体位点特异重组系统(attB+attP；attL+attR)。BP反应是DNA片段或者包含attB位点的表达克隆与包含attP位点的供载体（donorvector）之间进行的反应。BP反应产生入门克隆。•LR反应是含attL位点的入门克隆和包含attR位点的目的载体之间的重组反应。LR反应产生表达克隆。表达克隆包含目的基因和目的载体特异的启动子或者一些元件。Gateway®技术1.创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。2.混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway™LRClonase™酶，产生表达克隆。致死基因：DB3.1GatewayattB引物attB15’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTNN-3’attB25’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN-3’Prolinerichproteinlikeprotein(PRPL)SenseprimerGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAACATAAGCCCCCTGTCAntisenseprimerGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATAAGCACTCTCGCTAGT酶切连接载体•超表达pCAMBIA2300S•启动子pBINm-gfp5-ER和pBI121Gateway技术载体•超表达pGWB401pGWB501pGWB402pGWB502pGWB402ΩpGWB502Ω可能都要做融合蛋白了，与gfp或者his标签，这样以后就可以做WESTERN了。这边他们的超表达都是做的融合蛋白，不过要事先确定融合基因放在５‘还是３’，免得影响其功能。如果不确定就两种同时做。RNAi启动子启动子（截短策略）attL1attL2pDONR201+promoter棉花自己的启动子？？？诱导表达怎么工作的？我们怎么用？可以用在哪些地方？•loxP34bpCREgene•GlucocorticoidGRintron•EGFP效率低的问题：•连接反应效率低？•BP、LR反应效率低？•转化效率低？•切记抗生素•邓锋林负责载体的保管•谭家福负责相关酶的管理•每个人只给划平板转基因过程中的注意事项•大小皿及滤纸不能混用•转基因的共培皿及一些摇菌的三角瓶灭完菌再洗•转基因所挑的克隆块，每个克隆块分化苗的棵数•烟草转基因的假阳性问题（抗生素）•拟南芥的转化•公共卫生：到完皿之后，继完代之后，配完培养基之后•转基因苗移栽