章DNA的复制和修复08

第34章DNA的复制和修复（DNAReplicationandRepair）内容DNA的复制DNA的损伤和修复DNA的突变DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。蛋白质逆转录翻译转录复制复制DNARNA第一节DNA的复制DNA的复制：是指以原来DNA分子为模板合成出相同分子的过程。一、DNA的半保留复制DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semiconservativereplication)。ParentalStrandsStrandduplication1/2old1/2newStrandseparation半保留复制的实验证明1958年Meselson和Stahl的实验首次有力地支持了半保留复制方式。实验步骤：１.大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长12代。２.再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。３.裂解细胞。４.将裂解液放在CsC1溶液中进行密度梯度离心。５.在紫外光下可以看到形成的区带。二、DNA复制的起点和方式复制子:DNA复制从起点开始直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。复制起点:DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Originofreplication)，用ori表示。复制叉:DNA复制的生长点形状如同分叉故称为复制叉(replicationfork)。原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子。实验表明，它们都在一个固定的起点开始复制，复制叉移动方向大多是双向的，即形成两个复制叉或生长点，分别向两侧进行复制；也有的是单向的，只形成一个复制叉或生长点DNA的双向和单向复制复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制环状DNA复制时所形成的q结构起始点复制叉的推进用遗传学和生物化学的方法可以确定大肠杆菌染色体DNA的复制起点在基因图谱上的位置。起点oriCilvthr0/180Lacattl255075malAcysCtryAhistrpTre终点大肠杆菌复制起点和终点在基因图谱上的位置83min33minEvidencepointstobidirectionalreplicationLabelatbothreplicationforksDNA复制的不同方式A.直线双向B.多起点双向C.θ型双向D.θ型单向E.滚动环F.Ｄ环A.直线双向三、DNA聚合反应有关的酶酶反应式：n1dATPDNApolEdAMPn2dGTP+DNAdGMPn3dCTPMg2+dCMPn4dTTPdTMPDNA1．DNA的聚合反应和聚合酶1956年，Kornberg在大肠杆菌提取液中发现DNA聚合酶，以后陆续在不同生物中找到。+(n1+n2+n3+n4)PPiDNA聚合酶的反应特点：以四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物;反应需要模板的指导;反应需要有引物3‘-OH存在;DNA链的生长方向是5'→3'产物DNA的性质与模板相同。DNA聚合酶催化的链延长反应3´5´5´3´3´5´5´3´由DNA聚合酶催化的DNA合成反应ABCD模板-引物产物2.大肠杆菌DNA聚合酶大肠杆菌共有5种不同的DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ，II，III，IV，V。DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ,DNApolⅠ)理化性质：纯化的DNApolⅠ由一条多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。酶分子空间结构近似球体。DNApolⅠ约含1000个氨基酸残基，MW为103kD。经蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段：大片段（Klenow片段）有聚合酶和3'→5'外切酶活性，小片段有5'→3'外切酶活性。5'→3'外切酶活性3'→5'外切酶活性聚合酶NCKlenow片段(MW68kD)小片段(MW35kD)蛋白酶功能：聚合功能:通过核苷酸聚合反应使DNA链沿5'→3'方向延长。在引物DNA或RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。3'→5'外切酶活性──校对作用:这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸（对单链作用）。5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10个核苷酸。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用（切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体）。对冈崎片段5'末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。5'→3'外切酶活性──切除修复作用:焦磷酸解作用:DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。焦磷酸交换作用:催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。这两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。DNA聚合酶Ⅱ（DNApolII)DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApolⅠ不是DNA复制的主要聚合酶。1970年发现了DNApolⅡ。此酶为多亚基，MW88KD，每个细胞内约有100个酶分子。催化特性：5‘→3’聚合酶活力:该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有缺口(gap)的单链DNA部份，而且该单链空隙部份不长于100个核苷酸。3'→5'外切酶活性，但无5'→3'外切酶活性。该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。DNA聚合酶Ⅲ组成：DNApolⅢ全酶是由多种亚基组成的蛋白质，而且容易分解。现在认为它是大肠杆菌细胞内真正负责重新合成DNA的复制酶。组建作用DNA-dependentATPaseDNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNADNA聚合酶Ⅲ异二聚体DNAPolymeraseIIIholoenzymeCoreCoreclampst2tsubunitshold2coresinadimergcomplex(clamploader)gReplicationForkLeadingStrandsynthesisLaggingStrandsynthesis功能A．聚合:以模板作指导，以四种脱氧核糖核苷酸作为底物，并且需要有3'－ＯＨ的引物链存在，通过核苷酸聚合反应使DNA链沿5’→3’方向延长。催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶Ⅱ和I的15倍和30倍。B．3'→5'外切酶活性大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用合成速度（核苷酸/分）持续合成能力DNA聚合酶Ⅰ103,000400+++1,000-1,2003-20088,000100++-2,4001,500830,00010-20++-15,000-60,000≥500,000比较项目DNA聚合酶III切除引物修复修复复制功能聚合酶IV和V:2019年发现,它们涉及DNA的错误倾向修复(errorpronerepair）DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上切口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5‘-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的切口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用。3.DNA连接酶(DNAligase)连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP切口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链DNA的一条链的复制是半不连续的四、DNA的半不连续复制冈崎片段：1968年，冈崎等用3H－脱氧胸苷标记T4噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子。最初出现的DNA片段长度约为1000个核苷酸左右，称为冈崎片段（Okzakifragment）。复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链滞后链3´5´复制的起始DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´RNA引物的合成：以DNA为模板，NTP为原料，在引物合成酶催化下，合成10-几十个核苷酸。为什么？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA聚合以后再将其切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。核酸的拓扑结构是指核酸分子的空间结构。两条互相缠绕的双螺旋核酸分子表现出许多拓扑学的关系。在DNA的复制、重组、转录和组装等过程中无不牵涉到其拓扑结构的转变。拓扑异构酶（topoisomerase)：DNA在复制过程中双链需要解开。能引起DNA拓扑异构反应的酶为拓扑异构酶。DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。五、复制中的拓扑学问题DNA拓扑异构酶有两类：类型Ⅰ的酶——拓扑异构酶Ⅰ，能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，可减少负超螺旋。类型Ⅱ的酶——拓扑异构酶Ⅱ（旋转酶），能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量，可引入负超螺旋，它们协同作用控制着DNA的负超螺旋水平。原核细胞拓扑构酶Ⅰ的作用机制：酶与DNA结合使双链解旋;使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转;酶使另一条链经过切口，然后再将两断端连接起来;酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负性超螺旋。拓扑构酶II的作用机制：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，引入负超螺旋，可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力，从而促进双链的解开。真核生物拓扑构酶拓扑构酶I：消除正、负超螺旋类型I拓扑构酶III：消除负超螺旋拓扑构酶IIa：消除正、负超螺旋，不能引类型II拓扑构酶II：消除正、负超螺旋入负超螺旋不能引入负超螺旋大肠杆菌旋转酶（gyrase)又称为拓扑构酶II，反应需ATP提供能量，可连续引入负超螺旋，可消除复制叉前进时产生的扭曲张力。将DNA两条链解开，有赖于DNA解螺旋酶，这类酶通过水解ATP获得能量来解开双链，分解ATP的活力要有单链DNA的存在。如双链DNA中有单链末端或缺口，解螺旋酶即可结合于单链部分，然后向双链方向移动。大肠杆菌解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可以沿模板链的5‘→3’方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3‘→5’方向移动。这两种解螺旋酶的配合作用推动着DNA双链的解开。单链结合蛋白(SSB)：可阻止复性和保护解开的单链。DNA