环状RNA与疾病研究进展

研究生课程论文课程名称分子生物学授课学期2015学年至2016学年第一学期学院生命科学学院专业野生动植物保护与利用学号2015011145姓名孙文斌任课教师秦新民交稿日期2016年3月1日成绩阅读教师签名日期广西师范大学研究生学院制环状RNA与疾病研究进展孙文斌摘要：环状RNA(circularRNAs，circRNAs)是一类广泛存在于各种生物细胞中具有调控基因表达功能的非编码RNAs，它是一类由特殊的选择性剪切产生且在真核细胞中广泛表达的环状内源性RNA分子，具有结构稳定、丰度高和组织表达特异性等特征。研究表明，一些circRNA作为竞争性内源RNA(ceRNA)来发挥基因表达调控的作用。circRNA利用其microRNA(miRNA)应答元件结合miRNA，以阻断miRNA对其靶标表达的抑制作用，从而调控其他相关RNA的表达水平。如CDR1as对miR-7的海绵作用与肺癌、乳腺癌、胶质瘤及肌萎缩性脊髓侧索硬化等疾病发生相关。cANRIL可通过影响多梳家族参与动脉粥样硬化的发生。大量circRNAs的发现及其结构和功能的阐明不仅可以使我们更加深入地了解疾病的发生机制，而且为相关疾病的预防、诊断和治疗提供了新的方向。本文主要从circRNAs的种类、结构与产生机制、功能与疾病的相关关系等几方面作总结性的综述。关键词：环状RNA；MicroRNA海绵；反向拼接；抗疾病效应1circRNAs的种类circRNAs最早在20世纪70年代在RNA病毒中被发现的。[1-2]circRNAs最初的表达量极低，被认为是剪接体介导的拼接错误产生的副产品[3]或逃逸内含子套索的中间产物[4]。因此科学家并没有去关注circRNAs，且认为circRNA在生理过程中并不起主要作用。直到2010年，随着生物信息学技术的快速发展，circRNA这一类古老且具有保守特征分子的神秘面纱逐渐被揭开。Salzman等[4]发现了数以百计的与人类基因表达相关的circRNAs。Jeck等[5]在人类成纤维细胞中检测到了高达25000种circRNAs。Memczak等[6]则从RNA测序数据中鉴定出1950种人类circRNAs，1903种小鼠circRNAs和729线虫circRNAs。Guo等[7]发现了与多种人类细胞系相关的36种生物样本中的7112种circRNAs。Li等[8]在人类Hela细胞中发现了111种circRNA。目前发现的circRNAs根据其来源不同可以分为3大类，分别是：内含子来源的circRNA；外显子来源的circRNA；内含子-外显子来源的circRNA。2circRNA的结构与产生机制生命体的遗传信息通过转录从DNA传递到RNA，再通过翻译传递到蛋白质。通常情况下，真核生物的基因在转录后通过前体mRNA剪接（pre-mRNAspelicing）去除基因内部的非编码内含子序列，然后将外显子链接在一起，形成成熟的mRNA分子，翻译成蛋白质。包括人在内的高等真核生物的可以通过可变剪接，由一个基因产生多种不同功能的成熟的RNA分子及相应的蛋白产物。在真核生物中存在一种反向的可变剪接，使得基因的外显子序列反向首尾相接形成环状RNA。2.1外显子来源的circRNAJeck等[5]提出了外显子环化的两种模型：套索驱动环化（lariat-dirvencircularization）和内含子驱动环化（intron-pairing-dirvencircularization）。前者与外显子跳读有关，一个外显子的3ˊ剪接供体和另一个外显子的5ˊ剪接受体共价结合，即套索驱动的环化由外显子组成的剪接供体和剪接受体共价结合，接着切除内含子，然后形成circRNA（图A①）；后者则先由两个内含子通过碱基互补配对形成环状结构，再切除内含子，最后形成circRNA（图A②）。2.2内含子来源的circRNAZhang等[9]提出了内含子自身环化所形成的circRNA（circularintronicRNA，ciRNA）模型（图B）。2.3外显子-内含子来源的circRNALi等[8]在人类HeLa细胞中发现了与PolII相互作用促进亲本基因转录的circRNA，并且这种circRNA不仅由外显子和内含子共同组成，而且还定位于细胞核中。通过招募U1snRNP与其结合共同作用于PolII促进亲本基因的转录，科学家将这种新型的circRNA命名为EIciRNA（Exon-introncircularRNAs）。3circRNA的功能根据已有文献报道，circRNA具有以下显著特点：(1)与线性RNA不同，circRNA形成共价环状结构，因此不易于被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定[9](2)种类繁多[10]，有些circRNA甚至高于其相应的线性RNA10倍之多；(3)circRNA主要由外显子构成，少部分由内含子环化形成，也有一部分是由外显子和内含子共同组成；(4)一些circRNA富含microRNA(miRNA)反应元件(microRNAresponseelement，MRE)，可扮演竞争性内源RNA(competingendogenousRNA)角色，与miRNA结合，在细胞内发挥miRNA海绵的作用，抑制miRNA发挥功能从而调节基因表达水平[11]；(5)具出一定的组织、时序和疾病特异性[4,12,13]；(6)大多数circRNA为内源性ncRNA，仅有部分外源性circRNA是可以翻译表达的，例如丁型肝炎病毒(hepatitisDvirus,HDV)与含有内部核糖体进入位点序列(internalribosomeentrysite,IRES)的工程circRNA[14,15]；(7)不同物质间进化上保守[15]。这些特点显示circRNA在转录水平与转录后水平可能发挥着重要作用，可作为疾病诊断的理想标志物。3.1circRNA作为ceRNA或miRNA海绵circRNA充当miRNA海绵，竞争性抑制miRNA的转录调控，实际上代表了一类新型的ceRNA调节物（图1）。相较于其他类型的ceRNA，circRNA在细胞中表达量高且稳定性强，并具有更多与miRNA结合的位点，能够更加快速稳定地结合或释放大量miRNA，高效发挥其调控miRNA的作用，比线性的ceRNA更具有突出的ceRNA活性。环状RNA也可能是细胞外miRNA海绵，一些环状RNA有可能存在病毒miRNA的结合位点，与病毒miRNA的结合，从而破坏免疫应答［16］。然而，circRNA作为miRNA海绵，与miRNA相互作用的具体机制仍有待进一步探明。图13.2调控选择性拼接与基因转录先前研究已经表明，circRNA与旁路拼接和基因转录的调节有关。例如，Ashwal-Fluss等[17]发现环状Mbl是由拼接因子MBL的第二个外显子通过与典型前体mRNA竞争形成。环状Mbl侧翼内含子与其本身都含有保守的MBL结合位点，可与MBL特异性结合而且MBL的修饰水平显著的影响环状Mbl的形成，并且该效应依赖于侧翼内含子序列的MBL结合位点。这些发现表明一般拼接因子(例如MBL)可能会影响选择性拼接，而选择性拼接正是调节circRNA生成与典型RNA生成平衡的主要方式。而且，Chao等[18]注意到，鼠甲酸精基因(formin,Fmn)可通过反向拼接产生circRNA。值得注意的是，该circRNA含有mRNA捕获作用的翻译起始位点，并留下一个非编码转录子从而降低Fmn蛋白的表达。此外，Jeck等[19]发现，在人类成纤维细胞中，许多外显子来源circRNA都含有翻译起始位点，这些发现表明circRNA可通过隔离翻译起始位点的方式发挥mRNA捕获作用从而调节蛋白表达。3.3调节亲代基因表达最近的研究显示circRNA可以调节亲代基因表达。例如，Zhang等[20]发现circRNA的形成依赖于关键的侧翼RNA元件，这些RNA元件对于内含子套索环化逃逸脱支酶分离至关重要。这些circRNA几乎没有miRNA靶点富集，表明他们的功能具有独特性。研究[21]表明，一些circRNA细胞核内含量丰富，通过与聚合酶Ⅱ相互作用以顺势反应方式调控宿主转录活性。接着，科学家们又陆续在人类细胞中发现了另外一种可与PolⅡ相互作用的circRNA，这种环状RNA叫做EIciRNAs。EIciRNAs(例如circEIF3J,circPIAP2)主要定位于核内，可与小核糖核蛋白(smallnuclearribonucleoproteins,snRNPs)相互作用以顺势反应方式调控亲代基因的转录。与之类似，Li等[22]发现cir-ITCH及ITCH3'端未翻译器共有miRNA结合位点；进一步研究发现，cir-ITCH与miR-7、miR-17和miR-214相互作用可上调ITCH表达水平。总之，可以推测外显子来源的circRNA在细胞质内发挥调节作用，而内含子来源的circRNA(如ciRNA、EIciRNA)则在细胞核内发挥转录调节作用。3.4其他可能的功能一般情况下，很少有circRNA可翻译成蛋白质。然而，研究者报道，一些人工合成的在蛋白起始密码子上游插入了IRES(内部核糖体插入位点序列)的circRNA可在体外[23]或体内[24]翻译。与之类似，Perriman等[25]发现含有GFP开放阅读框的工程circRNA可在大肠杆菌内指GFP表达。有趣的是，截至目前，仅有一个天然形成的circRNA可以在真核细胞内编码蛋白质，即HDV，HDV是HBV的一种卫星病毒[25]。HDV与HBV病毒颗粒共同包埋产生同一种蛋白，这在病理学是一种独特现象，然而翻译规律却不典型，这很可能与特殊的病毒媒介有关[26,27]。然而，至今没有证据表明天然形成的circRNA可以翻译蛋白质。此外，科学家也报道了circRNA可能的其他功能[28,29]。例如，circRNA可作为RBP海绵，即MBL与cirMbl的直接相互作用，或作为RBP工厂的装配或变构调节。另外，circRNA亦可直接通过局部碱基配对靶向mRNA。一些circRNA甚至可以作为翻译模板，研究发现，合成circRNA可以高效的翻译蛋白质。这些发现表明仍需要深入的研究来进一步阐释circRNA的新功能。4circRNA与疾病4.1circRNA与肿瘤结合上述的circRNA的功能和近年来的研究报道我们知道，circRNA含有大量的miRNAs的MREs，可发挥ceRNA的作用。目前已知的circRNACDR1as可通过与miR-7结合间接调控miR-7靶基因的表达，CDR1as/miR-7可通过多种信号通路影响肿瘤的发生发展[30]。研究[31]表明，miR-7直接参与并引起肿瘤相关通路致癌因子表达下调的蛋白有：表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)、胰岛素受体底物1(insulinreceptorsubstrate-1,IRS-1)[32]、IRS-2[32]、癌基因Raf1[33]、活化的P21蛋白激酶1(P21-activatedkinase-1,Pak1)[34]、激活态CDC42激酶1(activatedCDC42kinase1,Ack1)[35]、蛋白酶体激活因子PA28γ[36]、核转录因子1YY1[37]、胰岛素样生长因子-1受体(insulin-likegrowthfactor-lreceptor,IGF1R)[38]、磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ(phosphatidylinositol3-kinasecatalyticsubunitδ,PIK3CD)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)[39],表明miR-7起抑制肿瘤生长的作用。此外，miR-7可通过靶向抑制IGFR1[40]和黏附灶激酶(focaladhesionkinase,FAK)上调钙黏素(E-Cadherin)表达水平，从而降低上皮间充质转化(epitheli