实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心精品文档，你值得期待15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。①浓度测定A260下读值为1表示40µgRNA/ml。样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40µg/ml。具体计算如下：RNA溶于40µlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40µg/ml=840µg/ml或0.84µg/µl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35µl，剩余RNA总量为：35µl×0.84µg/µl=29.4µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。10×MOPS电泳缓冲液浓度成分0.4MMOPS，pH7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25µl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备RNA样品取3µgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。③电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成①反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2μl2上游引物0.2μl3下游引物0.2μl4dNTP0.1μl5逆转录酶MMLV0.5μl6DEPC水5μl7RNA模版2μl8总体积10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。②反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2阳性模板上游引物F0.5μl3阳性模板下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6阳性模板DNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2内参照上游引物F0.5μl3内参照下游引物R0.5μl4dNTP0.5μl5Taq酶1μl6待测样品cDNA5μl7ddH2O32.5μl8总体积50μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量110×PCR缓冲液2.5ul2MgCl2溶液1.5ul3上游引物F0.5ul4下游引物R0.5ul5dNTP混合液3ul6Taq聚合酶1ul7cDNA1ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72ºC延伸5分钟。②PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。③将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6待测样品的待测基因实时定量PCR①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。体系配置如下：序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O30ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。8电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA500ng，100mg肺提取RNA200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反应反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。反转录反应条件如下。37°C15min（反转录反应）85°C5sec（反转录酶的失活反应）RealTimePCR反应选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18SrRNA(18SrRNA)做为内参。基因引物序列扩增片段长度NR2BNR2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213bpNR2B(–)ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18srRNA18srRNA(+)TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA198bp18sCGTTTATGGTCGGAACTACGArRNA(–)1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqTM（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1μl0.4μMPCRReversePrimer（10μM）1μl0.4μM模板（cDNA溶液）0.5μldH2O10μlTotal25μl全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18SrRNA。4管BDNF或者18SrRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5μl。2）三步法PCR首先95°C作用3min。PCR进行35个循环。步骤温度时间变性95°C30秒退火58°C30秒延伸72°C30秒融解曲线温度时间变温速度95°C0秒20°C/秒55°C15秒20°C/秒95°C0秒0.1°C/秒PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1将PCR反应的试管与反应板紧贴。2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍3微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。4不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。5对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。没有扩增产物：1在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。3检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。4检查模板和引物的用量。5增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：1减少循环次数或模板DNA的用量。2提高退火温度，但不要超过68℃。3重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：1建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。2最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。3大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。4建议使用1.75mmol/LMgCl2∶350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2∶500mmol/LdNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。6要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。7降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。8变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12kb时，应该尽可能的降低变性温度。9延伸：68--72℃下进行延伸操作。10循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。11长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶将PCR产物补平