生物化学第34章

第34章DNA的复制和修复(DNAreplicationandrepair)一、DNA的复制二、DNA的损伤修复三、DNA的突变一、DNA的复制（一）DNA的半保留复制DNA复制的三种可能模式ConservativeSemiconservativedispersiveAfteronegenerationAftertwogenerationsWatson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型oldnewDNA的半保留复制原来的亲代分子第一代子分子第二代子分子DNA半保留复制的实验证明1958年，Meselson和Stahl利用15N标记大肠杆菌DNA的实验，首先证明了DNA的半保留复制。他们让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长，经过连续培养12代，使所有的DNA分子都标记上15N。15N-DNA的密度比普通14N-DNA大，在氯化铯密度梯度离心时可以区分这两种DNA。DNA半保留复制的实验证明这时将大肠杆菌转移到普通培养基（含14N）上培养，经过一代以后，所有DNA的密度都介于15N-DNA和14N-DNA之间，说明其为14N和15N的杂合分子。两代后，14N分子和杂合分子等量出现。当把杂合分子加热，使它们分开成单链再离心，可见有一半与单链15N-DNA的密度相同，另一半与单链14N-DNA的密度相同。（二）DNA复制的起点和方式DNA上能独立进行复制的单位称为复制子（replicon），每个复制子都有复制起始点，可能还有复制的终点。DNA复制起始点一般有特定的序列，DNA在复制起始点处解开双链，形成一个复制泡（也叫复制眼）。有些DNA的复制从复制起始点开始向两边复制，也有些DNA的复制从复制起始点开始向一边复制，它们分别称为双向复制和单向复制。DNA复制的方向未复制DNA单向复制双向复制中国仓鼠卵巢细胞DNA复制的电镜照片大箭头所指为复制泡，小箭头所指为复制叉处的单链部分，注意二者在相反的链上。各种生物DNA的结构DNA有线性双链和环状双链，也有环状单链的。原核生物的染色体DNA和质粒，以及真核细胞中的线粒体和叶绿体DNA都是双链环状的，真核生物的染色体DNA是双链线性的。病毒的DNA有单链环状的，也有双链环状的，还有双链线性的。DNA上复制子的数目原核生物染色体DNA和质粒DNA就是一个复制子，从一个复制起始点开始完成整个DNA分子的复制。真核细胞一个染色体DNA上有许多复制子，许多复制起始点同时开始复制，每一个复制起始点完成一段DNA的复制，然后将各个片段连接起来。复制起始点的确定大肠杆菌染色体DNA只有一个复制起始点。在一个生长的群体中几乎所有的染色体都在复制过程中，因此离复制起始点越近的基因拷贝数就越多，也就是出现的频率越高。将从大肠杆菌中提取出来的DNA切成大约1%染色体长度的片段，通过分子杂交的方法测定各基因片段的频率，结果表明复制起始点oriC位于基因图谱的ilv位点处（83分附近）。一旦复制开始，复制叉向两侧以相等的速度向前移动。两个复制叉在离起始点180°的trp位点处（33分附近）相会合。大肠杆菌染色体DNA复制起始点的确定DNA的复制方式直线双向多起点双向θ型双向θ型单向DNA的复制方式D环线粒体DNA的复制采取这种方式DNA的复制方式2D环DNA的复制方式滚动环大肠杆菌的多复制叉染色体DNA酶促合成的引物链和模板链（三）DNA聚合反应有关的酶DNA聚合酶催化的聚合反应DNA聚合酶的反应特点①以4种dNTP作底物；②反应需要接受模板的指导；③反应需要有引物3’-羟基存在；④DNA链的延长方向为5’→3’；⑤产物DNA的性质与模板相同。大肠杆菌DNA聚合酶大肠杆菌有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，它们有各自不同的用途。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ由一条肽链（928个氨基酸残基）组成，含有一个锌原子，分子量109kD。它是一个多功能酶，具有以下活性：①5’→3’聚合活性；②3’→5’外切活性（校对活性）；③5’→3’外切活性（只作用于双链DNA）；④从3’端使DNA链发生焦磷酸解（聚合反应的逆反应）；⑤无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，得到C端324～928氨基酸残基的片段，称为Klenow片段，1-323氨基酸残基为小片段。小片段具有5’→3’外切活性，Klenow片段具有聚合酶活性和3’→5’外切活性。酶切位点Klenow片段的立体结构蓝色为模板链，红色为引物链。Klenow片段的活性位点DNA聚合酶Ⅰ的校对作用在正常聚合条件下，3’→5’外切活性不能作用于生长链；一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，生长链的3’末端核苷酸落入3’→5’外切活性位点，错配核苷酸被迅速切去，然后继续进行聚合反应。3’→5’外切活性起着校对的作用。校对作用越强，DNA复制的准确性越高。适当的错配有利于发生突变，有利于物种的进化。突变率太高也不利于保持物种的稳定性。DNA聚合酶Ⅰ的切口平移作用关于大肠杆菌DNA聚合酶的研究根据对各种DNA聚合酶在大肠杆菌细胞中的活性、合成DNA的速度、该酶基因突变对DNA复制的影响的研究，发现DNA聚合酶Ⅲ是大肠杆菌细胞中DNA复制的主酶，而DNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ的功能只是参与DNA损伤的修复。大肠杆菌中3种DNA聚合酶性质的比较项目聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ5＇→3＇聚合酶活性＋＋＋3＇→5＇外切酶活性＋＋＋5＇→3＇外切酶活性＋——相对分子量（×103）10388830一个细胞内分子数400？10~20生物学活性10.0515聚合速度（核苷酸/分）1000~20002,40015,000~60,000持续合成能力3~2001,500≥500,000功能切除引物，修复修复复制大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ亚基分子量亚基数目亚基功能α132,0002聚合活性ε27,00023’→5’外切校对活性θ10,0002组建核心酶τ71,0002核心酶二聚化γ52,0002依赖DNA的ATP酶，形成γ复合物δ35,0001可与β亚基结合，形成γ复合物δ’33,0001形成γ复合物χ15,0001形成γ复合物ψ12,0001形成γ复合物β37,0004两个β亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构δ与β结合两个α亚基各催化复制叉处一条链的合成。β二聚体的滑动夹子结构红、黄绿色各为一个β亚基DNA聚合酶Ⅳ和ⅤDNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是在2019年才被发现的。它们的功能是进行易错修复。DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶可以连接切口和粘性末端，T4噬菌体DNA连接酶除可以连接切口和粘性末端外，还可以连接平末端。DNA的连接类型（四）DNA的半不连续复制在复制叉处，两条新生链是同时合成的，新生链延伸的方向一条是5’→3’，而另一条是3’→5’，这就不符合DNA聚合酶催化反应的性质。为了解决这个矛盾，日本学者冈崎等提出了DNA的不连续复制模型，认为3’→5’走向的新生DNA链实际上是由许多5’→3’方向合成的片段连接起来的。DNA复制叉处的前导链和滞后链5’→3’链是连续合成的，3’→5’链是不连续合成的，因此称为半不连续复制。冈崎片段的发现1968年，冈崎等用3H-脱氧胸苷标记噬菌体T4感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子，最初出现的DNA片段的长度约为1000个核苷酸左右，这种片段称为冈崎片段（Okazakifragment）。用DNA连接酶变异的温度敏感株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，有大量DNA片段积累。这些实验都说明在DNA复制的过程中，首先合成较短的片段，然后再由连接酶连接成大分子DNA。原核生物和真核生物的冈崎片段细菌的冈崎片段长度为1000～2000个核苷酸，相当于一个顺反子（cistron）的长度；真核生物的冈崎片段长度为100～200个核苷酸，相当于一个核小体DNA的长度。DNA复制中的引物由于DNA聚合酶必须在已有的核酸链的3’-羟基上延伸新链，所以在前导链合成开始时以及滞后链的每一个冈崎片段开始时都需要有引物。RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA的过程称为转录，转录是不需要引物的。DNA复制的引物就是小片段的RNA，这个RNA引物的合成是由引物合成酶催化合成的。RNA引物的长度通常为几个核苷酸至十几个核苷酸。（六）DNA复制的过程DNA复制叉处的结构DNAligaseDNApolymeraseⅠOldOkazakifragmentOkazakifragmentPrimerLaggingstrandtemplatePrimerHelicase/primaseNewlysynthesizedleadingstrandDimericreplicativeDNApolymeraseβsubunit“slidingclamp”SSBLeadingstrandtemplateDNAgyrase大肠杆菌染色体oriC的结构DNA复制的起始ⅠDNA复制的起始ⅡDNA复制的起始ⅢDnaB有解旋酶活性，它每解开一个碱基对需要消耗2个ATP。DNA复制体的装配ⅠDNA复制体的装配ⅡDNA复制体的装配ⅢDNA复制叉的延伸Leadingstrand“core”DNApolymeraseⅢSSBτ2γRepproteinHelicaseⅡPrimosome3rdRNAprimerLaggingstrand“core”DNApolymeraseⅢ1stRNAprimer2ndRNAprimerGrowingOkazakifragmentDNA复制的终止Tus蛋白与Ter位点结合后起终止复制叉前进的作用。连锁体拓扑异构酶拓扑异构酶可以改变DNA双螺旋的连环数，其功能是引入超螺旋或解开超螺旋。拓扑异构酶可分为两类：类型Ⅰ的酶能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需提供能量；类型Ⅱ的酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP提供能量。拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅰ属于类型Ⅰ。它只能消除负超螺旋，对正超螺旋不起作用。拓扑异构酶在使DNA的一条链断裂时，由于酶与DNA结合，DNA链不能自由转动，超螺旋的扭曲张力不会自动消失。但是酶分子可牵引另一条链通过切口，然后使断链重新连接起来，从而改变DNA的连环数和超螺旋数。拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶Ⅱ属于类型Ⅱ，又叫旋转酶（gyrase）。它可连续引入负超螺旋，反应需要消耗ATP。在无ATP存在时，它可以松弛负超螺旋，但不作用于正超螺旋。大肠杆菌旋转酶由两个A亚基和两个B亚基组成，A亚基是抗萘啶酮酸和奥啉酸的作用位点，B亚基是抗香豆霉素A1和新生霉素的作用位点。这些抗生素均能抑制DNA复制，因而推测旋转酶对DNA复制是必需的。旋转酶的作用机制解旋酶解旋酶能将DNA两条链解开，每解开一对碱基，需要水解2分子ATP。大肠杆菌有许多种解旋酶，其中解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ可以沿着模板链的5’→3’方向移动，而rep蛋白则沿着3’→5’方向移动。过去认为在DNA复制中，这两种酶配合作用解开DNA双链，但上述酶经诱变并不影响DNA的复制。DnaB蛋白曾经分离出一些大肠杆菌DNA复制的温度敏感突变株。其中一株当培养温度由30℃升高到40℃时，DNA复制立即停止，分析表明dnaB基因发生了温度敏感突变。该基因产物DnaB是一种解旋酶，可沿DNA链5’→3’方向移动，由ATP提供能量。这就证明该解旋酶参与DNA的复制。单链结合蛋白大肠杆菌的单链结合蛋白（SSB）由4个相同的亚基组成，它的功能是与已经解开的单链DNA结合，阻止重新形成双链，保护单链部分不被核酸酶降解。原核生物的SSB蛋白与单链DNA的结合有正协同效应，当第一个SSB蛋白结合后，后面的SSB蛋白的结合力可提高103倍。因此一旦结合反应开始，全部单链DNA迅速被SSB覆盖。但真核生物的SSB蛋白没有这种协同作用。（七）真核生物DNA的复制真核生物染色体有多个复制起始点。