单细胞测序

第一章单细胞测序技术概览摘要:2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。前言2013年，单细胞测序技术（single-cellsequencing）荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中...2013年，单细胞测序技术开始成为科研界主流关注的焦点。前言2013年，单细胞测序技术（single-cellsequencing）荣膺《自然-方法》年度技术。单细胞测序技术有助于我们剖析细胞的异质性。它可以揭示肿瘤细胞基因组中发生的突变及结构性变异，而这些突变和变异往往有着极高的突变率。有了这些信息，我们就可以描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展及扩散范围。本文将介绍2013年单细胞测序技术在人类早期发育、癌症以及神经科学研究等几个重点领域的最新应用成果。1.单细胞测序技术简介本节将概述如何获得一个单细胞的基因组及转录组。单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术（amplificationtechnology）也是一大考验。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、背景噪声以及定量不准确等问题。最近所取得的技术进步有望部分解决上述问题，使单细胞测序技术能够走进更多的实验室，解决更多领域的科学问题。比较罕见的细胞、异质性的样本、与遗传嵌合或突变相关的表型、不能人工培养的微生物，这些都是单细胞测序技术能够一展所长的研究平台。使用单细胞测序技术能够发现克隆突变（clonalmutation）、隐藏的细胞类型，或者在大块组织样品研究工作中被“稀释”或平均掉的转录特征。1.1选择恰当的细胞说到分离单细胞，显微操作（micromanipulation）无疑是一项非常精确的技术，而且利用毛细管（microcapillary）可以直接吸取细胞内容物，但是这项操作也需要耗费大量人力。很多组织解离之后都能够制成单细胞悬液，这种单细胞悬液很容易操作，而且可以用细胞分选器（cellsorter），根据细胞表面表达的特异性分子标志物对细胞进行分类富集操作。这种策略也被用来分离非常微量的循环肿瘤细胞。1.2单细胞转录组策略现在有很多单细胞RNA测序操作流程可供选择，不过不管采用何种策略，首先都需要通过逆转录反应，利用RNA合成出cDNA。然后才会有所区别，比如有一些方法是对整个转录子进行测序，有一些方法只针对转录子的5'和3'端进行测序。不论采用何种方法，目的都只有一个，那就是捕获原始的RNA分子，然后均一的、准确地对其进行扩增。核酸的捕获效率主要受到逆转录反应的影响，不过我们可以使用更小的反应体系，选择更好的逆转录酶来进行改善。另外，采用模板转换技术（templateswitching）也能够保证被捕获的绝大部分转录子都是全长片段。减少反应循环数也能够改善核酸扩增反应，还可以借助“抑制PCR（suppressionPCR）”技术减少引物扩增，或者将取自不同样品的cDNA（这些cDNA都是分别做好标记的）混合到一起，提高起始反应模板浓度，用体外转录技术进行线性扩增（linearamplification）。另外，还可以利用特有的分子识别序列（molecularidentifiersequences）对每一个RNA分子进行标记，这样即便在经历了非均一的扩增之后，我们还是能够对原始的RNA分子数量进行绝对定量。1.3单细胞基因组策略全基因组扩增（whole-genomeamplification）的起始反应产物更少，只有一个DNA分子。这样在扩增反应时就难免出现不均一的问题，即可能在基因组中某些位点会扩增多次，而另外一些位点则无法扩增。解决这个问题最常用的办法就是多重置换扩增技术（multipledisplacementamplification,MDA），即使用随机引物，让这些引物与基因组广泛结合，同时使用一种特定的聚合酶，这种聚合酶能够置换与它自身附着在同一模板上的DNA链片段，形成一种反复分支结构（iterativebranchingstructure），扩增出大段的DNA。早期循环对整个扩增反应的均一性起到了决定性作用。有一种扩增技术采用了一种独特的引物，这样能够生成闭合环状的扩增子（amplicon），而且这种扩增产物不会再进一步复制，等于是在进行PCR扩增反应之前先进行几轮线性扩增反应。将反应按比例扩大，同时对反应情况进行实时监控都有助于改善基因组扩增成功率低的问题，另外减少扩增次数，准备更少模板的测序文库也是一个比较值得发展的方向。1.4一个细胞解决所有问题在单细胞研究工作中，扩大试验规模是确保采集足够多的生物多样性信息的关键。微流体设备（microfluidics）或微孔板技术（microwelltechnology）能够提供标准化、高通量的选择，而且由于这种设备的反应体积通常都比较小，所以反应效率也都比较高。不过微流体设备也有一定的限制，只能处理某些特定大小的细胞样品。当然，将待测分子用生物条码（barcoding）标记之后混合起来进行分析也是一条处理通量的途径。单细胞核酸扩增及测序技术正在不断成熟、完善之中。我们相信，随着单细胞试验操作变得越来越容易，成本变得越来越低，会有更多的科研人员选择使用单细胞测序技术，这将会像PCR技术一样成为每个实验室里的常规试验操作，帮助我们以更高的分辨率去研究问题、解决问题。2.单细胞测序技术——科研界主流关注的焦点技术单细胞基因组测序技术及单细胞转录组测序技术又掀起了一波新的科研浪潮，让科研人员们能够以新的视角看待发育、肿瘤及神经科学问题。对于不孕不育症夫妇而言，孕育一个孩子是非常困难的事情，而且这也会让他们的情感饱受折磨。即便他们怀孕了，也不是高枕无忧的，因为这些家长需要担心另外一个问题，如何生育一个健康的宝宝。对于那些存在遗传风险，需要借助体外受精技术（invitrofertilization,IVF）辅助的父母而言，胚胎植入前遗传学诊断（preimplantationgeneticdiagnosis,PGD）技术（即从早期胚胎中取出一个细胞进行遗传学疾病筛查的技术）是孕育出健康下一代的保证，虽然目前PGD技术也只能够对基因组中的一个、或少数几个位点进行筛查和诊断。由于取自早期胚胎的细胞数量都不会太多，所以极其珍贵，临床医生们必须从这些宝贵的细胞中尽可能地获取有价值的信息。而单细胞全基因组测序技术（single-cellwholegenomesequencingmethod）就有望解决早期胚胎发育及其他科研领域里存在的这些重要的问题。由于单细胞分离技术以及单细胞中痕量的DNA或RNA扩增及测序技术的进步，科研人员们得以对单细胞的整个基因组或转录组（而不是少数几个位点）以前所未有的高分辨率进行扫描和研究。美国哈佛大学（HarvardUniversity）的SunneyXie等人就是在IVF工作中进行单细胞基因组测序研究的课题组之一，他们用第一极体和第二极体（所谓极体指的是受精卵分裂时“遗弃”的细胞成分，可以反映染色体的健康状况）验证了他们新开发的全基因组扩增技术。Xie等人最近发表的文章介绍了他们对8位女性供体的研究成果，研究发现极体活检（polar-bodybiopsy）和单细胞测序都能够准确地反映胚胎染色体非整倍体（aneuploidy）的情况，其中就包括唐氏综合症（Down'ssyndrome）这种染色体数目过多的情况，也包括染色体丢失，或者遗传自父母的单核酸突变（single-nucleotidevariation）等情况（Cell,doi:10.1016/j.cell.2013.11.04019December2013）。Xie发现染色体非整倍体平均只需要在每一百个基因组位点中挑出一个位点进行测序就足够了，所以这要比传统的方法成本更低，而且准确性也会更高。Xie与这篇论文的合作者——中国北京大学（PekingUniversity）的FuchouTang和中国北京大学附属第三医院（PekingUniversityThirdHospital）的JieQiao针对这些接受IVF帮助的女性开展了一项临床研究。他们对这些志愿者的胚胎极体进行了基因组扩增和全基因组测序研究，以此来判断胚胎是否健康，是否适于进行移植、受孕。据Xie介绍，如果将时间提前两年，在临床上开展这项研究工作几乎是不可能的，当时有大批没有遗传问题，可是不能受孕的夫妻给他发邮件寻求帮助。目前这次临床研究的第一位婴儿将在年内降生。Xie指出，他并没有想到他们的技术能够这么快地走向临床，给患者们提供切实的帮助。”SunneyXie很快就能够看到他们课题组开发的基因组扩增技术被应用到临床PGD实际工作当中的表现情况了。2.12013年测序技术回顾单细胞测序技术可谓是科技发展史上的一大创举。一个细胞里的DNA或RNA仅仅处在皮克（picograms）级的水平，这么少的量远远达不到现有测序仪的最低上样需求。因此科学家们必须先对单细胞内的微量核酸分子进行扩增，而且必须保证尽可能少地出现技术误差，以便开展后续的测序及其他研究。直到最近，也还是只有少数几位专家相信能够对单细胞进行可靠的研究。虽然早在几年前就开始有研究团体在宣传、推广单细胞基因组及转录组测序技术，但是这些技术是最近这两年才开始被大范围接受，其中就包括从事神经科学研究、肿瘤及微生物生态学研究的科研人员。据美国Fluidigm公司的联合创始人，斯坦福大学（StanfordUniversity）的StephenQuake介绍，几乎从PCR技术诞生的第一天开始，就不断有人尝试用PCR技术进行单细胞基因表达研究及单细胞基因组研究。但是由于种种原因，单细胞测序技术直到现在才算是刚刚起步。DNA和RNA扩增技术的不断改进，尤其是最近这两年新出现的进步给刚刚涉足这个领域的科研人员在开展试验时提供了非常丰富的选择。工业界也提供了无数种商业化的、而且价格低廉的单细胞核酸扩增试剂盒及读取技术。Fluidigm公司就在2013年推出了世界上第一款单细胞RNA测序自动化准备系统（single-cellautomatedprepsystemforRNA-seq）。所有这些技术上的进步极大地降低了科研人员们进入单细胞研究这个领域的技术门槛。瑞典卡罗林斯卡研究院（KarolinskaInstitutetinSweden）的RickardSandberg在谈到单细胞RNA测序时说道：“大家等这一天已经等了好几十年了。直到今天，由于技术的进步，这些试验才变得足够简单，而且成本也能够让大家接受，所以才能够走进千千万万个实验室。”进行单细胞研究的核心问题其实是：为什么要进行单细胞研究？这主要是因为如果将成千上万个细胞混在一起进行研究，就会模糊我们对大脑、血液系统、免疫系统，及其组成这些系统的细胞之间异质性（heterogeneity）的认识。美国宾夕法尼亚大学（UniversityofPennsylvania）的JamesEberwine就认为，当你的研究深入到单细胞层面时，你就会失去对整个系统的把控，但是如果你能够从整个系统中挑选多个不同的单细胞进行研究，则可以重建出整个系统，而且这种重建过程能够提供更多更有价值的信息。有大量很难对大块组织进行研究的科研领域也都会从这些最新的单细胞研究技术中获益。这种单细胞测序技术不仅有助于我们认识细胞之间的差异，还可以为我们提供一个新的比较层面，这也是大家期盼已久的，能够重新定义细胞类型的层面。可与大家这种极高热情相伴的却是各种各样的技术难题，包括单细胞分离、基因组或转录组扩增，以及数据解读等各个方面。试验成本也是需要考虑的一大因素。通常来说，对细胞进行分析时所需要的细胞数量要比对组织进行分析时所需要的组织数量多很多，所以在决定是否应该进行单细胞研究时一定要谨慎，要根据实际情况做出合适的判断。“我们真的需要进行单细胞研究吗？如果