单细胞藻类培养

LOGO第二章单细胞藻类培养CompanyLogo第二章单细胞藻类培养一、单细胞藻类的种类与生物特性（一）单细胞藻类培养的种类常用的饵料微藻主要有：牟氏角毛藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体；三角褐指藻：虾、蟹、海参、海胆的幼体、种贝；中肋骨条藻：虾、蟹幼体；底栖舟形藻：鲍、海参、海胆、埋栖贝类、舔食螺类的附着幼体；底栖卵形藻：同上；等鞭金藻：贝、虾、蟹、海参、海胆的幼体；亚心形四片藻：轮虫、卤虫、种贝及虾的后期幼体；海水小球藻：同上；钝顶螺旋藻：虾、蟹幼体及配合饲料的添加剂；CompanyLogo（二）单细胞藻类的生物学1、盐度：大多数单胞藻盐度适应范围很宽。10-40大多数单胞藻能适应。如扁藻、盐藻、小球藻在10-80的盐度中能正常生长。CompanyLogo2、温度①适温绿色巴夫藻10-35℃；扁藻7-30℃；盐藻4-40℃。因此大多数单细胞藻类适合在20-25℃下培养。一些单胞藻适合在较高温度下生存；如钝顶螺旋藻生存最适为28-34℃。CompanyLogo②低温单胞藻一般忍耐性较强，在一定的低温条件下产生的形态和生理变化是可逆的。利用其在低温环境下呈休眠状态的特点，可较长时间保存单细胞藻类。如在-20℃温度下，冰冻20d的三角褐指藻浓缩藻液，解冻后，培养2d即可恢复正常生长。CompanyLogo3、光照5000-10000lx，适合大多数单细胞藻类的培养。某些藻类适合在弱光下培养：如中肋骨条藻：5000lx较适宜，而10000lx产生抑制作用）；三角褐指藻：3000-5000lx某些单细胞藻适合较强的光照：等鞭藻：7000-9000lx角毛藻:10000-15000lx某些单细胞藻类适合在强光下培养：如钝顶螺旋藻：30000-35000lx。CompanyLogo4、pH7.5-8.5是大多数藻类的适宜范围。也有一些藻类适合碱性条件：如钝顶螺旋藻8.6-9.5。CompanyLogo5、繁殖主要以二分裂繁殖为主。可将培养过程分为：延缓期、对数（指数）生长期、相对生长下降期、静止期和衰亡期。CompanyLogo二、藻种的分离（一）采样个体较大的浮游藻类，可用密浮游生物网在水中捞取。但在水产动物的人工育苗中所需要的饵料微藻，一般个体很小，往往在几微米到十几微米，用浮游生物网无法采集到，需要把水样采回实验室处理。水样采回后，进行显微镜检查，如果发现有需要分离的藻种，而这种藻种的数量较多时，可立即进行分离，若数量少，必须先经过预备培养，待数量增多后再分离。CompanyLogo（二）预备培养1、容器：通常采用三角烧瓶。2、培养液：各种藻类的培养液存在差异。土壤抽出液Ⅰ:取土壤1kg，加纯水1000ml，煮沸60min，在暗处放置2d，过滤，以滤液600ml加纯水400ml。土壤抽出液Ⅱ：取土壤1kg，加纯水1000ml，再加入NaOH2-3g，煮沸120min，冷却后过滤，滤液直接使用。土壤抽出液Ⅲ：取土壤1kg，加纯水2000ml，煮沸煎浓，把上部泥浆倾入烧瓶中澄清，静置一昼夜后，次日吸取上清液，再煮沸煎浓。第三天在如法煎浓，最后倾入三角烧瓶中，加棉花塞，煎浓，直至得到1000ml的深褐色的土壤抽出液。每次使用后，煮沸灭菌保存。CompanyLogo土壤抽出液Ⅳ：取田园土壤1kg，加水2000ml，搅拌均匀，浸泡，用前吸取上清，煮沸消毒后使用。海泥（或土壤）抽出液Ⅴ：用海滩上砂质较少，有机物较多而又不是过分淤黑的上层软泥，清除其中的小树枝和小石块等杂物，以容量计算1份泥加2份水，充分搅拌均匀，静置1-2min，待粗砂，小石沉下，把上层泥浆倾入铝锅内，弃去底部粗砂，小石等杂物。静置24h，吸取上清液使用。CompanyLogo3、管理①搅动或摇动：浮游种类应每天摇动一次。附着种类应静置不动。②经常观察，掌握时机及时分离：如发现藻类呈淡淡颜色，即进行显微镜检查，如需分离藻类已占优势，应立即进行分离。如没有需要分离的藻类，便重新进行采样及预培养。CompanyLogo（三）分离方法：1、微吸管分离法：选直径约5mm的细玻璃管，在酒精喷灯上加热，待熔，快速拉成口径极细的微吸管。微吸管的另一端套接一条长约30cm或8cm的医用乳胶管。在分离操作时长乳胶管的另一端用牙齿咬紧，如用短乳胶管则用手指压紧，用以控制吸取动作。将稀释的水样，置浅凹载玻片上，在显微镜下观察挑取要分离的藻类细胞，吸取时把微吸管对准藻细胞，然后牙齿或手指放松，由于气流的关系，藻细胞被微吸管吸入，接着吸入的水滴放入另一凹玻片上，观察是否是目标单胞藻。然后把分离出的藻细胞移入预先装有培养液的试管中，管口塞棉塞，在适宜光照下培养。每天摇动一次。CompanyLogo2、水滴分离法将微吸管插入水样中约2cm深，提取微吸管，待无水滴自然滴下，把微吸管与载玻片接触，即有一小水滴水样留在载玻片上。按照上述方法，吸取水滴3-4滴，水滴作直线排列，相互间隔一段距离。然后在显微镜下观察每个水滴，如果某一水滴中藻细胞只有一个需要分离的藻细胞，即用培养把水滴连同藻类细胞冲入试管中，并加入培养液到试管容量的1/4，试管口塞上棉花塞，放在适宜光照下培养，每天摇动一次。CompanyLogo3、平板划线法方法同光合细菌。由于单细胞藻类大多不适合在固体培养基中生长，因此，分离效果较差。CompanyLogo二、单细胞藻类的培养方式（一）纯培养与单种培养：1、纯培养：纯培养即无菌培养，是指排除了包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。2、单种培养：在生产性培养中是不排除细菌存在的，为了区别而称单种培养。CompanyLogo（二）开放式培养和封闭式培养1、开放式培养：是把藻类培养在敞开的广口玻璃瓶，水族箱等容器中进行培养，设备简单，为目前主要的培养单细胞藻类的形式。特点：充足的光照和通风，繁殖迅速。容易受敌害生物的污染。2、封闭式培养：在封闭容器中进行培养，仅有充气管，培养液加入管和藻液抽出管与外界有接触，其余不与外界接触。特点：减少敌害生物污染，成功率高。生长速度较慢。CompanyLogo（三）一次性培养、半连续培养和连续培养1、一次性培养：在各种容器中，配制培养液，把少量藻种接种进去，在适宜的环境条件下培养，经过一段时间藻种繁殖达到较高的密度，一次全部收获。2、半连续培养：半连续培养是在一次性培养的基础上，当培养的藻细胞达到或接近收获的密度时，每天收获藻液的一部分并补充等量的培养液，继续培养。3、连续培养：一般为室内，人工光源，自动控温，封闭式充气培养。连续培养能使藻细胞生长繁殖的条件稳定，藻细胞始终处于指数生长期，生长迅速，产量高。CompanyLogo三、培养方法：（一）培养容器：三角烧瓶、玻璃钢水槽和水泥池等均可作为单胞藻的培养容器。（二）容器工具的消毒：同光合细菌的消毒方法。（三）培养液的制备：选择合适的培养液配方，按照配方配制。CompanyLogo（四）接种1、接种质量：一般要求选取无敌害生物污染，生活力强，生活旺盛的藻种培养。颜色正常，无大量沉淀和无明显附壁现象。2、藻种数量:藻种培养：藻液容量和新配培养液比例为1：2-1：3，一般一瓶藻种可接成3-4瓶。中继培养和生产性大量培养由于培养容器容量大，藻种供应有时不足，可根据具体情况灵活掌握，但最少不宜低于1：50。一般以1：10-1：20较适宜。3、接种时间：最好在8-10时，不宜在晚上。CompanyLogo（五）培养1、日常管理①搅拌和充气：通过搅拌或充气增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，补充由于藻细胞作用对二氧化碳的消耗。帮助沉淀藻细胞上浮而获得光照。防止水表面长出菌膜。搅动、摇动一般每天至少3次，定时进行，每次半分钟。充气。可24小时连续充气或间歇充气。CompanyLogo②调节光照人工光照：自然光：极端易变是太阳光源的特点，必须根据天气情况，不断调节光照度。室内尽可能利用近窗口的漫射光，防止直射光照射，光照过强时可用竹帘或布帘遮光调节。室外一般应有棚室顶架，用活动白帆布或彩条布蓬调节光照，阴雨天，可短期利用人工光照。CompanyLogo③调节温度一般单胞藻培养不须控温设备，冬季培养应加取暖设备来提高温度。CompanyLogo④注意酸碱变化CO2被吸收利用，导致藻液pH上升。其他营养物质的吸收，也会引起pH的上升或下降。如pH过高或过低，可用1mol/L的盐酸或氢氧化钠调节。CompanyLogo2、培养藻类生长情况观察和检查藻类的生长情况，可以通过藻液呈现的颜色，藻细胞的运动或是悬浮情况，是否有沉淀和附壁现象；菌膜和敌害生物污染迹象的有无等观察而了解大概情况。CompanyLogo（六）防治敌害生物的措施1、预防措施：①严格防止污染：防止污染的重点应该放在生产性藻种培养这一级上。因为：藻种培养在室内，培养容器为玻璃瓶。防止污染条件较好。只要藻种级没有敌害生物污染，扩大培养到水池，生产周期短，就是发生污染敌害生物还需要一段生长、繁殖时间才能达到一定数量，所以影响不大。CompanyLogo②保持培养藻液的生长优势和数量优势首先接种的藻种最好取自指数生长期。接种量大，从培养开始培养藻液在培养液中即占数量上的绝对优势。CompanyLogo③做好藻种的分离、培养和供应工作在培养过程中，严格防止污染是重要的，但从目前单细胞藻类的培养水平看，绝对防止敌害生物污染是不可能的，要根本的解决这个问题，就必须不断的补充新的“纯”藻种来取代在长期培养过程中已经受污染的藻种，这才可能使培养较好的顺利进行。CompanyLogo2、清除、抑制或杀灭敌害生物的方法①使用过滤方法清除大型敌害生物：饵料微藻都很小，对污染的大型敌害生物（如轮虫等）可用过滤方法清除。清除轮虫等敌害生物可用网孔小于60um的密筛绢网过滤，必须连续过滤。CompanyLogo②使用药物抑制或杀灭敌害生物培养亚心形扁藻和湛江等鞭藻出现尖鼻虫危害时，在藻液中加0.003%医用浓氨水，可有效杀死尖鼻虫不影响藻细胞生长繁殖。如果在藻液中细菌大量繁殖时，致使藻细胞生长缓慢大量下沉，在lL藻液中加入少量青霉素，可抑制细菌的生长。CompanyLogo③改变环境条件杀灭敌害生物利用亚心形扁藻耐高盐的特性，使用提高比重的方法杀灭敌害生物。在被污染的藻液中加入食盐，把藻液比重提高到1.056-1.060，游仆虫等敌害生物可被杀死。盐藻培养受变形虫危害时，在1000ml藻液中加盐70-110g能杀死尖鼻虫，游仆虫及个体较小的原生动物。当亚心形扁藻、湛江等鞭藻中有尖鼻虫、游仆虫等敌害生物时，可以采用盐酸酸化藻液的办法进行杀灭。方法1000ml藻液中加1mol/L盐酸3ml，边加边搅拌同时测定pH值，待pH降到3时，停止加盐酸，酸化0.5-1h，即可将上述敌害生物杀死。然后用氢氧化钠将藻液恢复原pH，藻液经23-25h后，就可恢复游动及正常生长繁殖。CompanyLogo四、几种比较特殊的培养方法（一）同槽培养在对虾育苗池施肥培养生物饵料供同池培养的对虾幼体食用，生物饵料培养与对虾育苗在同一水池内同时进行，即同槽培养。1、培养池：水容量大，室外、露天。2、清池消毒：3、藻种：从海区抽上来，经沉淀池沉淀的海水，用150目筛娟网过滤后灌入池中。4、施肥：第一天氮肥：2-3mg/L、磷肥：0.2-0.3mg/L以后每天施氮肥：0.5-1.5mg/L、磷肥：0.05-0.15mg/L铁肥和硅肥不必每天施，隔2-3天施一次或完全不施。铁肥：0.3-0.5mg/L硅肥：0.05-0.1mg/LCompanyLogo（二）专池培养专池培养：与同槽培养不同的是使用专用饵料池培养，施肥量加大，培养时间短浓度大。1、2、3步骤同上。4、施肥：第一次施硝酸钠：30mg/L磷酸氢二钾：3m