第二章--基因定位和遗传作图

1第二章基因定位和遗传作图2概述细胞做图：利用三点测验法计算交换率或重组率，并以此作为基因间连锁关系和相对距离绘制连锁图，常以mu为单位染色体定位：利用同线法、缺失法、单体法、三体法把基因定位到特定的染色体上。细胞水平上的基因图又称细胞遗传图区域定位：利用染色体步行、FISH和基因克隆等方法从细胞遗传学水平，将基因定位到染色体的具体区带。分子定位：利用分子标记、DNA芯片技术，将基因确切定位在DNA上的具体位置上。3第一节顺反子学说一、重组试验和连锁图1.噬菌体突变型噬菌体T4的突变型rⅡ和野生型rⅡ+在不同菌株上的表现噬菌体T4E.coliB株E.coliK（λ）株rⅡ+（大而清晰的噬菌斑）–rⅡ++（小而模糊的噬菌斑）+（小而模糊的噬菌斑）2.噬菌体突变型间的杂交图3.连锁图r47r104r101r106|r51r102—|—————|————|—————|—|———————|—————|———1.31.01.6|1.91.6A区|B区4第一节顺反子学说二、互补试验和顺反子学说1.顺反位置效应和互补试验（1）同一顺反子中的突变位点（等位）基因型表型是否互补m1m2—|———|———|—顺式++野生型——|———|———|—m1+—|———|———|—反式+m2突变型无—|———|———|—（2）不同顺反子中的突变位点（非等位）基因型表型是否互补m2m3—|——————|——————|—顺式++野生型——|——————|——————|—m2+—|——————|——————|—反式+m3野生型+—|——————|——————|—2.顺反子学说内容（cistron、muton、recon）例5第一节顺反子学说三、基因内互补intrageniccomplementation1.概念和机理机制：可能是由于两个突变基因所产生的失活产物结合，成为具有活性的蛋白质。如果将两个有关纯合体的抽提物混合时看到互补现象，叫离体互补或体外互补。6第一节顺反子学说2基因内互补与基因间互补的区别基因间互补基因内互补发生机率普遍存在只少数能发生缺失突变能发生互补不能发生酶活性同野生型明显低于野生型（仅25%）互补结果可完全恢复野生型表型最多只能使表型恢复到野生型的25％，而且突变位点相距愈近则互补程度愈弱发生地点在任何两个非等位基因之间同一基因内的若干不同的突变型之间7第二节遗传作图和染色体定位一、有性杂交重组定位(三点测交法)例题二、细菌基因定位例题1.中断杂交作图2.基因重组作图3.转化基因定位4.转导基因定位5.性导基因定位三、体细胞杂交定位物种间体细胞杂交→杂种细胞→各种clone→同线法基因定位四、缺失定位1.单体定位法2.染色体缺失定位法图8第三节染色体区域定位一、染色体步行(chromosomewalk)法1.概念2.类型：反向PCR、锅柄PCR、不对称PCR、SONPCR二、荧光原位杂交法（florescenceinsituhybridization，FISH）1.概念优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区域定位。缺点：必须在已知探针的情况下方可进行2.原位杂交的步骤图三、基因克隆1.功能克隆(functionalcloning)2.定位克隆(positionalcloning)：也叫图位克隆(Map-basedcloning)第四节分子标记分子标记的类型：（1）基于杂交的分子标记：RFLP标记，小卫星DNA标记（SSR）（2）基于PCR的分子标记：①单引物PCR标记，如RAPD、ISSR标记；②双引物PCR标记，如AFLP标记；③双引物特异PCR标记，如SSR标记（3）其他一些新型分子标记：如SNP标记、STS标记、EST标记分子标记的优点（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各发育时期均可检测。（2）数量极高，遍及整个基因组。（3）多态性高，等位基因变异随处可见。（4）表现为“中性”，即不影响目标性状的表达。分子标记的意义10第四节分子标记一、RFLP限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）：1.优点：RFLP是发展最早（Bosterin等1980）的分子标记技术。①无表型效应；②一般表现为共显性；③具有种族特异性，它对分析一个分离群体中来源不同的染色体片段具有重要价值；④标记范围遍及全基因组；⑤在不同的物种之间具有通用性。2.缺点：操作复杂、成本高、费时等。二、RAPD随机扩增多态性DNA技术（RandomamplifiedpolymorphicDNA)优点：（Willians1990）①能反映整个基因组的变化；②不需DNA探针，无需合成特定序列引物；③高效灵活，可在短期内获得大量的多态性DNA片段，亲缘关系非常近的个体也能识别；④操作简单易行，不需要接触放射性物质，简便、快速、费用低、分子识别率高、对环境污染小等。缺陷：重复性和稳定性较差11第四节分子标记三、AFLP扩增片段长度多态性（Amplifiedfragmentlengthplymorphism）优点：（Zabeau和Vos，1992），(1)可标记的数目是无限的；(2)多数具有共显性；(3)DNA用量少，而且对模板浓度的变化不敏感；(4)扩增片段较短，分辨率高；(5)利用特定引物扩增，退火温度高，可靠性高。缺陷：操作技术复杂，需要酶切、连接等步骤。四、SSR标记SSR，简单重复序列（Simplesequencerepeat）又叫微卫星标记。应用：多态性分析和新基因的发现、定位与作图。特点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组；(2)呈现多基因特点，信息含量高，表现为共显性遗传；(3)可采用PCR技术进行检测，且重复性好；(4)对DNA数量及纯度要求不高，即使是部分降解的样品也可；(5)标记带型简单，条带一致、客观、明确。12第四节分子标记五、SNPSNP（singlenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性）优点：(1)SNP分布广泛，多态性丰富；(2)易于实现自动化分析；(3)具有稳定的遗传特性。(4)SNP基因座的片段更短，更适合PCR扩增；(5)易于对复杂性状进行关联分析。SNP标记可与DNA芯片技术结合：将不同的寡核苷酸固定在芯片上，标记待测DNA，一次就可检测很多SNP标记。六、STS序列标签位点（Sequence-taggedsite，M.Olson，1989)1.类型：（1）特异DNA序列；（2）无序的DNA片段：未知片段序列标签2.特点：产生的信息十分可靠。对基因的研究、新基因的克隆以及基因图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。13第四节分子标记七、SCAR（Sequence-characteramplifiedregions，特异序列扩增区域标记）是在RAPD的基础上发展起来的。优点：可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。八、ISSRISSR（inter-simplesequencerepeat,简单序列重复区间扩增多态性）：是对SSR的发展，由Zietkiewicz等(1994)创建优点：稳定性好、所需DNA样品量少，技术简单，多态性高。可用于遗传多样性分析、遗传作图、品种鉴定、基因定位及分子标记辅助育种等研究。九、基因与氨基酸同源序列比对图（蛋白质分子标记）14第五节DNA芯片技术一、概述1.基本概念DNA芯片（DNAChipTechnology）、DNA微阵列（DNAmicroarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotidearray）。生物芯片包括：DNA芯片、蛋白质芯片2.DNA芯片的主要类型（1）根据探针的来源分①原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短②DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活（2）根据探针的大小分①Oligo-Chip8nor20n→expression②cDNA-Chip2,000n→expression③GenomicChip50,000n→genomicanalysis15第五节DNA芯片技术二、DNA芯片技术的基本步骤1.芯片制备（1）支持物的预处理：支持物(硅芯片、玻片或瓷片)预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。（2）DNA芯片阵列的制备：将制备的基因探针（已克隆的基因片段PCR或人工合成的DNA片段）、打印（喷墨打印或针式打印）2.准备样品:分离纯化cDNA,mRNA→扩增→标记(荧光、生物素、放射性标记）3.分子杂交样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交(30min)4.检测分析软件进行进行图象分析和数据处理16第五节DNA芯片技术三、DNA芯片技术的应用1.DNA测序2.基因表达分析3.基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析4.基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因四、基因芯片技术的优点1.规模大2.高度平行性3.快速高效4.高灵敏度5.高度自动化17顺反子的测定用T4噬菌体一个特殊基因区的不同突变株研究互补作用，获得下列资料，请判断，本区应有几个顺反子？各包括哪些突变型？１２３４５６1－＋－＋－－2＋－＋－＋＋3－＋－＋－－4＋－＋－＋＋5－＋－＋－－6－＋－＋－－18顺反子的测定E.coli的8个用T4突变株都不能在没有组氨酸的培养基上生长(his-),两两进行重组测验，发现所有的顺式杂合体都能在基本培养基上生长。而反式杂合体中，有的能在基本培养基上生长(+)，有的则不能(0)，如下表所示，确定这8个突变位点分属于几个不同的顺反子？突变体１２３４５６788000000+07++++++060000005000004000030002001019顺反子的测定假如上题的8个突变体测试产生了下列结果，结论是什么？反式杂合体在基本培养基上的生长情况突变体1２３４５６788++++++007++++++06++++005++++04++003++020010例题普通生物的基因定位ABC42abc42Abc8aBC8ABc92abC92AbC358aBc3581000细菌基因定位某杂交：HfrABCstrs×F－abcstrr→经检测后代的基因型和菌落数分别是：ABCABcAbCAbcaBCaBcabC总计800308040104040104021体细胞杂交定位杂种细胞系ABCDE人的基因OPQR+–++–+–+–––++++–––––人的染色体序号123–+–+–––––+++––+根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体的情况，进行基因定位22缺失作图A~J系是顺反子Y的一系列缺失。突变品系1~10同A~J分别进行杂交，得到下列结果（+和0表示后代能否产生野生型）。指出顺反子Y中从左到右的突变品系1~10的顺序。|顺反子Y|12345678910|A|A00000+00+0|G|B+00+++00+0|B|C+00+++0++0|H|D++0+++0+++|C|E00+0+++0+0|I|F++0+++++++|D|G0+++00++0+|E|H0++000+000|F||J|I++++00++0+J++++++++0+3721084156923FISH步骤制备中期染色体↓在载玻片上DNA原位变性↓杂交（在载玻片上，将放射性标记探针与之杂交）↓复性洗膜↓放射自显影检测、结合染色体形态进行基因定位