第五章-STR自动分型解析

第六章STR自动分型STR自动分型特点：自动化程度高快速、灵敏、准确、稳定重复性好核心：建立多基因复合扩增体系时采用3-4种荧光染料分别标记不同的STR基因座引物，同一种荧光染料标记的STR基因座扩增产物大小不重复。复合扩增产物的片段分离识别及各个等位基因命名由自动化设备完成。荧光标记STR复合扩增实质：采用四、五种荧光染料，其中一种用于染料与复合扩增产物混合后同步电泳的分子量内标DNA片段，余下的3或4种染料颜色标记STR基因座。荧光染料标记在引物的5′端，扩增后使相应PCR产物的一条链均携带标记引物的荧光染料。使扩增产物在检测设备上易识别。注意事项:同一荧光标记的不同STR的等位基因片段范围不能重叠，前一个STR最大的等位基因与后一个STR最小的等位基因相距最少10bp。在一个荧光复合扩增体系中，组合荧光染料的发射波长相差越大越好。荧光标记的分析方法荧光法：亦称荧光PCR技术（fluoresencePCR,F-PCR），是1995年由美国PE公司首先研制成功。•在荧光染料与引物保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在荧光染料与引物分离后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。荧光法融汇了PCR的灵敏性、DNA的特异性和光谱技术精确定量的优点，电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，不需要做PCR后处理或检测，完全闭管操作。荧光标记方法示意图毛细管电泳图谱8repeats10repeatsLocus18repeats9repeatsLocus2步骤步骤：1多色荧光标记STR复合扩增。2扩增产物电泳前进行处理。3毛细管电泳分离STR片段，激光诱导的荧光检测，由设备检测并数据化存储。4自动数据采集并分型。荧光颜色分离，计算片段大小，确定各个等位座的基因分型。毛细管电泳•毛细管电泳仪的基本结构包括高压直流电源，荧光激发光源，荧光检测器，自动样品盘和控制进样、电泳、检测与记录的计算机。适用范围：能够检测100～500bp范围，长度相差1bp的两个DNA片段。分离DNA片段的机制•毛细管中的聚合物溶液在一定的浓度下形成筛网状结构。DNA片段在溶液中泳动时，不同片段DNA受到的阻力不同，小片段较大片段受到阻力小，易通过。变性的DNA片段电泳迁移率与片段的大小表现为线性关系。荧光标记STR基因分析技术是利用荧光标记的引物在PCR扩增STR基因座时，使PCR产物的一条链带上荧光标记。这种带有荧光分子的DNA片段在凝胶中从阴极向阳极迁移，按片段长度大小排列，当迁移到阳极端的激光扫描仪的扫描窗口，荧光染料受到激发，发出一定波长的光，按荧光强度记录下来，每一个带荧光染料的DNA片段电泳轨迹按各自通过激光扫描窗口的实际时间被记录下来，以荧光吸收峰来表示每一个片段。峰值越高，表示该片段量越多；峰出现的时间与片段大小有直接关系，片段越小，峰越早出现。计算机保存所有片段通过扫描窗口的实际时间及其荧光特征。过程ABI310的检测路径图ABI310遗传分析仪（310GeneticAnalyzer）毛细管聚合胶注射器自动取样盘缓冲液电极缓冲液毛细管电泳原理电泳上样前样品处理变性对检验结果的影响对近百份血液(斑)、精斑、烟头及组织等生物样品分型结果进行比较发现，使用310电泳时，样品变性与否不影响检验结果,可简化了检验方法。310上样样品组成为12ul去离子甲酰胺、0.3ul～0.5ulROX及lulPCR扩增产物，混匀后即可上样电泳。电泳前未变性而得到与变性一样检验结果的原因可能为：第一去离子甲酰胺(中性或弱酸性)本身有变性作用；第二于7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳中60℃电泳时本身可使样品变性；第三上述一、二的联合作用。甲酰胺及ROX对检验结果的影响长久暴露于空气中的去离子甲酰胺被氧化成甲酸盐，后者在电泳进样时有两个不利作用，一是甲酸盐会与PCR产物中的DNA竞争吸附于毛细管上，减少PCR产物中DNA上样量.二是甲酸盐本身会淬灭荧光，这两个作用的结果是降低毛细管电泳检测灵敏度，使本该能检见PCR扩增产物的结果表现为阴性。PCR扩增后模板DNA量会成千上百万倍增长，有时分析结果时虽可以看到很高PCR峰，但无法分析这些结果，原因是甲酸盐竞争的结果使ROX进样量很少(甲酸盐也能降解DNA)，无法比对分析。所以，去离子甲酰胺应分装于0.5ml离心管内，冰冻保存，防止氧化，每次使用一个；电泳时ROX用量应合适，太多则浪费，太少则电泳顺序越靠后的样品，有可能无法分析结果。去离子甲酰胺较甲酰胺纯度为高，可增加毛细管电泳检测灵敏度。DNA分型•电泳对荧光颜色不同的DNA片断的峰进行长度检测，并对应不同的颜色。DNA片断与内标比较后确定长度。•最后与以同样方式确定的等位基因Ladder比较，得到未知样本的PCR产物片断分型。310分析原始图谱（Rawdata）STR等位基因分型流程数据收集确定峰标记峰与Ladder对比Genotype读取等位基因颜色分离分析者浏览数据确定结果GeneScanGenotyper光谱分离前的现象荧光检测器对多色荧光信号进行检测时，荧光染料间的发射波长差值越小，不同的荧光染料间存在明显的光谱交叉重叠,光谱交叉重叠形成的干扰信号就越强。当干扰信号达到和超过数据分析设定的阈值时，就被误判为一个片段峰，一个荧光标记在不同荧光在相同的位置上显示大小不同的伪峰、无法识别片段。光谱分离概念：每种荧光染料标记的特殊颜色的一系列片段峰单独区分出来，同时消除不同颜色间的干扰峰，这个处理过程就叫光谱分离。步骤：1设定一个判断信号峰的信号强度阈值。根据一个峰信号最强的颜色，将该峰归到相对应的颜色组中，就可以把峰信号归到不同的颜色组中。2消除一种颜色峰中的存在的其他的干扰信号。重点：建立matrix文件根据Matrix数值表，消除干扰信号，只保留单一、最强的颜色峰。该峰的峰高和面积在处理前后无变化。matrix文件•Matrix数值表：用来定量表现荧光片段峰中各种颜色信号强度相对的比例关系的数值表，在STR荧光标记检测分析技术中称为Matrix数值表。•matrix文件：由此数值表构成的相应计算机文件称为matrix文件。•matrix文件是在电泳matrix标准品时，计算各种颜色峰之间的平均干扰强度值而获得。•注意事项：当更换缓冲液、毛细管、激光管、荧光检测器等物时，需重新建立matrix文件。矩阵处理(Matix)Matrix及Ladder对结果分析的影响1对于使用仪器，国外实验室通常做法是一般每隔3～6个月做一次Matrix，以有利于得到准确的分析结果。2每次电泳时都应同时电泳Ladder，如果采用以前做的Ladder分析Profilerplus9个STR位点时，大部分检材大片段STR位点D18S51、D7S820在3l0上均能自动标上等位基因名称时，仍可采用该Ladder分析电泳结果。如果多数等位基因表现为OLAllele(off—ladderallele)则应考虑重新电泳Ladder。毛细管的更换ABI公司早先推荐检验STR的毛细管电泳次数为100次，以后又提高到200～300次。大量使用后认为，一般情况下，每根毛细管电泳可超过千次。更换毛细管的条件为：首先电泳时引物峰出现后吸收值基线高于2048RFU以上；其次TH019.3、10等位基因无法区分；其三在其它条件均不改变的条件下，分析已知血斑结果时，杂峰多。其中第二点最为重要。DNA片段分子量计算•分子量内标：含有一系列已知碱基数的标记DNA片段。•内标片段的电泳相对时间数据，描述了各个已知碱基数的内标DNA片段电泳迁移速度与片段大小的关系。•利用已知碱基数的内标DNA片段与电泳获得的相对时间值，可建立一个直线回归方程。•已知一个未知片段电泳获得的相对时间值，就可通过方程式得知未知片段大小。•注意事项：未知片段不能超出内标长度的范围。内标红色峰的片段大小等位基因分型Ladder:包含扩增体系中每个基因座的全部的已知等位基因。Ladder中每个基因座等位基因的荧光标记与未知样本扩增产物的标记种类相同。Ladder经颜色分离和计算分子量大小后，程序对Ladder中的等位基因命名。未知样本数据中的各种颜色及每种颜色各片段与Ladder中的相应的颜色和等位基因范围相比较，通过比较样本中的片段与Ladder中等位基因相同，如相同，就用该等位基因命名，不同，就识别为off-ladder。D3S1358(8alleles)VWA(14alleles)D16S539(9alleles)D2S1338(14alleles)BluepanelGreenpanelYellowpanelOrangepanelD21S11(24alleles)D8S1179(12alleles)D18S51(23alleles)TH01(10alleles)FGAlow(19alleles)FGAhigh(9alleles)250bp*139bp200bp160bp300bp340bp350bp150bpLIZ-labeledGS500DNAsizingstandard100bpRedpanelD19S433(15alleles)D5S818(10alleles)TPOX(8alleles)D13S317(8alleles)D7S820(10alleles)CSF1PO(10alleles)AMEL(2alleles)Figure5.6,J.M.Butler(2005)ForensicDNATyping,2ndEdition©2005ElsevierAcademicPress通过与等位基因标准比对来进行STR分型（STRgenotypingisperformedbycomparisonofsampledatatoallelicladders）MicrovariantalleleDNA分型图谱分型标准品等位基因命名错误在ladder中，每个基因座的各个等位基因的量不是完全相等，电泳检测时，其相应的信号强度也不同。若某个基因座的某个等位基因片段相对较少，电泳时上样量又偏少，峰的阈值设置过高，ladder中该等位基因未能被正确识别。在对ladder进行等位基因命名时，相应基因座的等位基因全部或部分命名不能被命名或错误命名。D3S1358(8alleles)VWA(14alleles)D16S539(9alleles)D2S1338(14alleles)BluepanelGreenpanelYellowpanelOrangepanelD21S11(24alleles)D8S1179(12alleles)D18S51(23alleles)TH01(10alleles)FGAlow(19alleles)FGAhigh(9alleles)250bp*139bp200bp160bp300bp340bp350bp150bpLIZ-labeledGS500DNAsizingstandard100bpRedpanelD19S433(15alleles)D5S818(10alleles)TPOX(8alleles)D13S317(8alleles)D7S820(10alleles)CSF1PO(10alleles)AMEL(2alleles)Figure5.6,J.M.Butler(2005)ForensicDNATyping,2ndEdition©2005ElsevierAcademicPress•如果这个未识别的等位基因是ladder中某个基因座的第一个等位基因，计算机系统就会把第2个等位基因错误的命名为等位基因1.，该基因座的样本的等位基因也必然减少1个等位基因命名。•如果在某一个基因座的第1个等位基因前出现伪峰，这峰是由于PCR扩增滑脱造成的。当上样量过大或峰阈值设置过低的，这伪峰就误认为是该基因座的等位基因1.该基因座的样本的等位基因也必然增加1个等位基因命名。处理方法•为防止这种错误出现，要求STR