双荧光素酶报告实验

双荧光素酶报告实验实验名称：双荧光素酶报告实验实验基础知识：荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinuspyralis的萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照,使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子,研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照,使测试不被实验条件变化所干扰。通过这种方法,可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性,比如,培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因,如CAT,β-Gal和GUS是不可能的,由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。相反,结合萤火虫(Photinuspyralis)和海洋腔肠(Renillareniformis)双荧光素酶的系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。实验原理：将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。从这两个图谱中可以发现，ppGL3-Basic这个载体主要是用于评估miRNA与靶基因3’UTR的结合，靶基因的3’UTR放在荧光素酶的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，而pRL-TK这个载体则表达海肾荧光素酶，将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时，pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。3、pmir-GLO将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体上，偏差更小且单质粒转染比双质粒共转染更简单。该质粒也是由promega公司开发的，图谱如下所示：萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶，同时在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，检测灵敏度高。荧光素酶报告基因被广泛用于miRNA靶基因验证。荧光素酶报告基因的原理在于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至pGL3-basic载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。同时，为了减少内在的变化因素，比如：培养细胞的数目、细胞转染和裂解的效率等对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinillaluciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录效率的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂LuciferaseAssayReagentII时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶活性。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&GloReagent试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，进行第二次测量，称之为双荧光素酶报告基因实验。实验检测步骤：一、样品准备：1质粒转染细胞（1）细胞铺板：将细胞按50%的密度接种到细胞培养12孔板内。（2）转染：16h左右细胞约70%时转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置3个复孔。首先设计四组：1.空白组（转染试剂+细胞）2.质粒组3.质粒+miRNANC组4.质粒+miRNAmimics组2.1配制质粒组：按照每空50ng质粒，同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，标记为A。2.2配制miRNANC/mimics：miRNANC/mimics的终浓度为20nM，同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，分别标记为B、C。2.3配制对应转染试剂：按照每孔0.5μL转染试剂,同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，标记为D。2.3稀释好的四组试剂常温孵育5min。2.4将稀释好的质粒DNA和miRNAmimics分别和对应转染试剂混匀，常温孵育20min。2.5将2.4步骤中试剂对应加入孔中。2.6转染6h后，换新鲜完全培养基。2双报告基因检测（1）质粒共转染36-48h后，弃去培养基，用100μL1XPBS清洗细胞。（2）倾斜12孔板，吸干剩余的PBS。（3）去离子水将5XPLB(裂解液)稀释成1XPLB（现配现用），使用前放到常温。（4）每孔加50μL稀释好的1XPLB，置摇床振摇20-30min以保证裂解缓冲液完全裂解细胞。（5）选用白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μL，加入100μL预先混好的LuciferaseAssayReagentII，2s后测数据，检测荧光素酶反应强度。注意此步需在避光条件下进行。（6）测定结束后，每孔添加100μL预先混好的Stop&GloReagent，静止2s后，测数据，检测内参海肾荧光素酶反应强度。（7）记录读数:每个样品会有3个数值：RLU1—萤火虫荧光素酶反应强度,RLU2—内参海肾荧光素酶反应强度,计算两组数据比值，即RLU1/RLU2。（8）分析数据：比较1、2组可以发现由于对照组未转染质粒，因此检测不到荧光素酶反应强度。比较3、4组，由于转染microRNAmimics进行microRNA的过表达，萤光素酶的活性降低，提示microRNA可能参与抑制靶基因的表达，需要结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。