园艺植物组织培养第4章

第四章愈伤组织的形成和植株再生成熟细胞脱分化细胞再分化器官胚状体愈伤组织植物的再分化形式有两种，器官发生型和胚胎发生型，在有些情况下，再分化可以直接发生于脱分化的细胞中，无须经历愈伤组织阶段，但大多数情况下，再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的。4.1.1愈伤组织形成的条件4.1愈伤组织的形成离体:与植株分离，从其它组织与器官的抑制中解脱出来。合适的培养条件：大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下，都能产生愈伤组织。由此可见，愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。当然，外植体的类型和外植物体原来在植株上所处的位置（反映了内源激素水平）对愈伤组织诱导的影响也不能忽视。外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期诱导期分裂期形成期4.1.2愈伤组织形成的过程•诱导期：细胞分裂的准备期☆诱导期是细胞准备进行分裂的时期。接种的外植体材料的细胞通常都是成熟细胞，处于静止状态，细胞大小没有多大变化，外观无明显特征，但细胞内物质代谢旺盛，王凯基等（1981）在研究离体培养的油橄榄茎段时发现，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。☆诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到40h以上。•分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期•分裂期是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅速分裂，分裂期主要表现如下：•1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。•2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。3.细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。4．细胞的核和核仁增大到最大。5.随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新的细胞壁的合成极快。总之，分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。•形成期：从愈伤组织到器官发生•形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。•进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织（meristemoid），称做分生组织结节。•分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节——由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。•此期细胞分裂已基本停止，细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞，因此有人又将此期称为分化期。以上对愈伤组织形成过程的时期的划分并不具有严格的意义，实际上，特别是分裂期和形成期往往可以出现在同一块组织上。另外，有一些研究者曾反复指出的，虽然细胞脱分化的结果在大多数情况下是形成愈伤组织，但这绝不意味着所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。相反，脱分化后可直接分化为胚性细胞而形成体细胞胚。1愈伤组织的生长一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。4.1.3愈伤组织增殖的方式外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较难；花器脱分化较易，而茎叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。2愈伤组织的继代培养脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态。然而，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结构。烟草愈伤组织在8周培养期间形态的变化A是与琼脂培养基垂直方向的切面B是与琼脂培养基平行方向的切面一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞，因此，由它所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，即不同的再分化能力。4.1.4愈伤组织的状态及其调控来源于不同植物或同一植物不同部位的愈伤组织,在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异，如颜色黄或白；外观光滑或粗糙；结构致密或松脆；遗传生理功能有胚性或无胚性。1优良愈伤组织的特性（优良的愈伤组织通常应具备以下4个特性中的2-3个特性）①旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。②高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物。③容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。④经过长期继代保存而不丧失胚性，方便对它们进行各种遗传操作。2.愈伤组织的类型主要根据对小麦、高粱和玉米等禾谷类植物体细胞愈伤组织的研究，王海波将愈伤组织分为3种主要类型：类型Ⅰ：保守分裂型，结构致密，生长较慢，容易分化成苗类型Ⅱ：亢进分裂型，结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增殖很快类型Ⅲ：衰败型，结构疏松，生长缓慢，色泽暗淡注意：1.在这3种类型之间还存在许多过渡类型。2.类型Ⅰ和类型Ⅱ之间在一定程度上可以相互转变，衰变型细胞在一定程度上也可以得到控制。能够促进这种转变和控制的因子有几种，其中最主要的是植物激素和氮源形态。氮源除了供给培养物氮素营养外，氨态氮还具有促进细胞分裂的作用，硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。当增加生长素浓度促进细胞分裂的效果不明显时，增加培养基中的氨态氮可起到明显的促进分裂的作用；当使用细胞分裂素或降低生长素对细胞分裂的抑制效果不显著时，增加培养基中的硝态氮或减少氨态氮，可起到显著的抑制分裂的作用。致密愈伤组织（A）与疏松愈伤组织（B）细胞结构的比较1.巨大细胞；2.管状细胞；3.细胞间隙3愈伤组织状态的调控（1）选择适当的基因型和适当的外植体虽然几乎所有高等植物的器官和组织都有可能产生愈伤组织，但同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同，同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同。•基因型材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。不同植物种的器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。•器官和部位通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异。如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。•年龄年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的器官形成频率低，愈向上部，苗的分化频率越高。因此在组织培养中，要及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。2.选择正确的培养基培养基的各种成分和物理性质，都对器官发生产生一定影响，但起决定作用的仍然是植物生长调节剂，特别是生长素和细胞分裂素的配比。3.采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。加入一些常规培养基中不用的物质和条件。4.2器官分化愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形态建成，可再产生完整的植株。形态建成：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、再分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方式发生，并产生无明显形态或极性的无序结构组织块，这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。只有满足某些条件，才可从愈伤组织发生再分化而产生苗或根的分生组织，甚至胚状体，进而使它发育成苗或完整植株。•4.2.1器官发生•概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程。•发生方式：有两种发生方式•（1）直接发生：外植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）•（2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种途径：1．器官发生途径通过茎芽的分化形成不定芽实现，指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。器官发生途径产生再生植株的基本方式有3种：（1）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况；（2）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（3）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。颠茄悬浮培养细胞先分化根后形成芽的过程2．胚状体方式（somaticembryo）指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。（后一节中介绍）4.2.2影响茎芽分化的因素1化学因素主要是激素的种类和浓度。生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高有利于根的形成和愈伤组织的形成生长素/细胞分裂素适中有利于根芽的分化低有利于芽的形成生长调节物质的使用甚微，一般用mg／L表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mg／L，细胞分裂素0.05—10mg／L。GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfacetissuecultureintheAfricanVioletNosucrose(0%)Veryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.tissuecultureintheAfricanViolettissuecultureintheAfricanVioletSucrosereducedto1%Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredtissuecultureintheAfricanVioletSucroseincreasedto5%Shootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanVioletNoBAPProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplanttissuecultureintheAfricanVioletBAPreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplanttissuecultureintheAfricanVioletNoNAAPoorshootdevelopmentandnoroo