基因工程及其在食品中的应用

基因工程及其在食品工业中的应用黃金米富含铁质含胡萝卜素一般白米转基因植物与农作物的抗性中国抗病毒白菜抗虫玉米抗除草剂耐储转基因农作物耐储转基因植物瑞士金大米烟草双抗石竹棉花荧光蘑菇转基因动物荧光斑马鱼荧光猪硕鼠绿荧光猴鲑鱼基因工程疫苗转基因烟草能够产生狂犬病抗体美国含乙肝疫苗马铃薯墨防腹泻蔬菜Geneengineering＊从狭义上讲：基因工程(又称DNA重组技术，DNARecombination)是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入到另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。通过基因工程获得新性状的生物体微生物称为——工程菌新类型的动物称为——工程动物、转基因动物。新类型的植物称为——工程植物、转基因植物。＊从广义上讲：基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术指外源基因重组、克隆和表达的设计和构建（即狭义的基因工程）；下游技术指含有外源基因的生物细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。基因工程操作的基本过程大致可以分为以下几个步骤：1、从供体细胞中分离出基因组DNA（或合成基因），用限制性内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切）2、用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（简称接）3、借助于细胞转化手段等手段将DNA重组分子倒入受体细胞（简称转）4、短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称增）5、筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）基因工程的工具酶目的基因基因工程的载体基因重组转化、增殖和表达基因工程在食品工业中的应用基因工程食品卫生安全管理条理基因工程工具酶工具酶（Enzymeoftools）：在基因工程中应用的酶统称为~。包括体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，如DNA聚合酶、限制性内切酶、修饰酶和连接酶等等。目前，常用的工具酶已有300多种。一限制性内切酶限制性内切酶（restrictionendonuclease）:是一类以环状或线形双链DNA为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。1、限制性内切酶的类型及特性分为三种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。是根据分离出此酶的微生物的学名而定的。命名原则：取微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成三个斜体字母加以表示，菌株名以非斜体字母再加在后面。如果同一菌株中先后发现几种不同的限制性内切酶，则用罗马数字加以表示。例：EcoRⅠE:来源于Escherichiacoli的属名的第一个字母Co:来源于Escherichiacoli的种名的头两个字母R:表示株名Ⅰ：表示该菌中第一个被分离出来的酶2、限制性内切酶的命名3、限制性内切酶的作用机制限制性核酸内切酶以环状和线形的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有了3′—OH基团和5′—P基团的片段。限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。不同的限制性内切酶各有相应的识别序列。现在发现的限制性内切酶的识别序列多数由4、5、6个核苷酸组成。4、限制性内切酶的识别序列EcoRⅠ的识别序列是：GAATTCCTTAAGHindⅢ的识别序列是：AAGCTTTTCGAASau3A的识别序列是：GATCCTAG它们具有共同的特点，即呈现碱基互补对称。识别序列可以按从5′-3′走向的单链DNA表示。如5′AAGCTT3′3′TTCGAA5′可以写成5′AAGCTT3′。5、限制性内切酶切割DNA的位点和切割片段的末端DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为切割位点。表示方法：或/限制性核酸内切酶在DNA上切割的位点一般在识别序列内部，如GGATCC等。少数限制性内切酶在DNA上的切割位点在识别序列的两侧，如GATC等。经限制性核酸内切酶切割产生的DNA片段末端：两种形式：1、粘性末端：一类是两条DNA链断开的位置是交错对称的，产生的DNA片段末端的一条链多出1至几个核苷酸，同具有互补核苷酸的另一DNA片段末端可以粘结，这样的DNA片段末端称为粘性末端。2、平末端：两条链上断裂的位置处在识别序列的对称结构中心，产生的DNA末端是平齐的，称为平末端。二、DNA连接酶DNA连接酶（DNAligase）：能催化两个DNA片段末端之间的3′-OH和5′-P基团形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶称为~。种类：①大肠杆菌DNA连接酶（E.coliDNA连接酶）②T4-DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶只能连接具有互补粘性末端的DNA片段，反应系统中必须含有NAD作为辅助因子。T4-DNA连接酶即可以用于双链DNA片段互补粘性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。反应系统中必须加有ATP作为辅助因子。三、DNA聚合酶常使用的DNA聚合酶有：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和T4DNA聚合酶等。DNA聚合酶的共同特点：能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5′—3′的DNA聚合活性：催化单核苷酸结合到DNA模板的3′-OH末端，以单链DNA为模板，从引物的3′末端按模板顺序从5′3′延伸。CCGE.coliDNApolⅠCCGATAGCCTGGCTATCGGAMg2+4dNTPGGCTATCGGA目前采用的碱性磷酸酯酶有两种:1、细菌碱性磷酸酯酶(BAP)2、小牛肠碱性磷酸酯酶(CIP)碱性磷酸酯酶能催化从单链或双链DNA或RNA分子中除去5′-磷酸残基，即脱磷酸作用，使DNA或RNA末端的5′-P成为5′-OH。四、碱性磷酸酯酶在基因工程中的应用：1、在DNA重组技术中除去DNA片段的5′磷酸，防止自身环化。2、在用32P标记DNA的5′磷酸末端之前，除去磷酸。T4多聚核苷酸激酶：能催化ATP上的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5′-OH末端上，使其磷酸化。主要作用是为DNA的5′末端标记，标记待测的DNA片段（ATP上的γ-磷酸是放射性的）。五、T4多聚核苷酸激酶S1核酸酶：其主要特征是降解单链DNA或RNA，包括不能形成双链的区域（如发夹结构中的环状部分），但降解DNA的速度大于降解RNA的速度，降解反应的方式为内切和外切，当酶量过大时会伴有双链DNA的降解。在基因工程中应用：常用它切平DNA双链中突出的单链末端，使产生平末端，在质粒组建和DNA重组中被广泛使用。六、S1核酸酶（S1Nuclesse）反向转录酶（Reversetranscriptase）：能以RNA为模板，反向转录合成出对应的DNA（单链或双链），因此，通过反向转录酶的作用，可以从某一基因的mRNA来合成出该基因，以获得目的基因。反向转录酶也能以DNA为模板合成DNA。七、反向转录酶目的基因：按照人们预先设计的蓝图，获得所需要的特异基因，即~。目的基因主要是编码蛋白质（酶）的结构基因，如抗逆性相关基因、工业用酶相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因等。目的基因分离目的基因的方法1、鸟枪法（Shotgun）2、酶促合成法3、化学合成法以目的基因的mRNA为模板，在反向转录酶的作用下合成互补的DNA，即cDNA(complementaryDNA)，然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段，与适当的载体重组后转入受体菌中扩增，获得目的基因的cDNA克隆。mRNA—cDNA－dscDNA。2、酶促合成法DNA或RNA序列的合成：按照已知基因的碱基顺序，将单核苷酸或核苷酸片段一个一个或一个片段一个片段地聚合起来。一般先合成DNA短片段，再依次连接成完整的目的基因链。目前，化学合成寡核苷酸片段的能力一般局限在150—200bp以内，这种方法适合分子较小的基因的合成。3、化学合成法基因克隆载体（genecloningvector）：把能承载外源DNA片段（基因）并将其带入受体细胞的传递者称为~。基因载体必须具备的几个条件：（书上P19）①本身是一个复制子，能自我复制。②相对分子量要小，小分子易处理，限制性内切酶切点少，适于接受目的基因。酶切位点应位于载体复制的非必需区。基因载体③能给寄主细胞（受体细胞）提供可选择性标记、可供辨认的表型特征，以便人们进行筛选。④克隆载体必须是安全的。目前应用的基因载体：质粒载体、噬菌体载体和病毒载体，以及由它们互相组合或与其他基因组DNA组合而成的载体。质粒载体：以质粒DNA为基础构建而成的载体。质粒：是一种存在于宿主细胞中染色体以外的裸露的双链DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。一、质粒载体根据质粒在寄主细胞中拷贝数的多少，将质粒分为两种类型：即严紧型质粒和松弛型质粒。严紧型质粒：拷贝数少的，只有—至几个拷贝，称之严紧型质粒。松弛型质粒：拷贝数多的，10个拷贝以上，一般10-200，有的能复制几百个或上千个拷贝，称之松弛型质粒。构建质粒载体一般选用分子小和松弛型的质粒。构建的质粒载体应具有复制起始点，能在受体细胞内复制。质粒载体还应有1～2种选择标记基因（如抗生素的抗性基因Amr[青霉素抗性]Tcr[四环素抗性]等）。另外质粒上有允许外源DNA组人的克隆位点。通常可采用这两种方法：①选择性抽提法用溶菌酶溶菌，形成的细胞碎片因染色体DNA与质粒DNA有相对分子质量上的差异，用高速离心方法而分离。上清液经乙醇沉淀后可得到质粒DNA的粗制品。质粒DNA的分离提取方法：②碱性SDS法（sodiumdodecylsulfate,十二烷基硫酸钠）：先用碱性SDS（pH12.0～12.6）处理含有质粒的宿主细胞，然后用NaAc（pH=4.8）处理，使混合液的pH降低到7.0左右，使质粒选择性地复性，而染色体DNA随同SDS和蛋白质一起沉淀下去。再经高速离心将质粒DNA留在上清液而达到分离的目的。纯化方法：①碱性蔗糖密度梯度离心法②氯化铯——溴化乙锭密度梯度离心法③硝酸纤维素膜吸附法鉴定方法：①凝胶电泳法②电镜法质粒DNA纯化和鉴定方法：噬菌体（Phage）：是病毒的一种，把感染细菌的病毒专门称为噬菌体。二、λ噬菌体载体噬菌体载体：由噬菌体构建的基因载体叫~。能作为基因载体的噬菌体主要是λ噬菌体。①λ噬菌体是一种温和噬菌体②能承载比较大的外源DNA片段λ噬菌体头部容许包装入DNA分子大小75%~105%的DNA片段。λDNA上约有20kb的区域对它生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代。③有多种限制性核酸内切酶识别位点用λ噬菌体构建克隆载体的原因：①删除某种限制性内切酶在λDNA分子上的一些识别序列，只在非必需区保留l——2个识别序列。②用合适的限制性内切酶切去部分非必需区，但是由此构建的λDNA载体不应小于38kb。③在λDNA分子的合适区域插入可供选择的标记基因。构建λ噬菌体载体的基本原则：①插入型载体（Insertionvector）：此类载体即为λDNA基因组中缺失部分非必要基因，只含有1个可供外源DNA插入的限制性内切酶位点的λDNA载体。②替换型载体（Replacementvector）：该载体是在λDNA的可替换片段两端具有两个限制性内切酶位点，酶切后替换片段与带有所有必需基因的左右双臂分开，由外源DNA片段取代之。λDNA载体分为两类：M13噬菌体：是感染大肠杆菌的一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子（+链DNA）。M13噬菌体感染雄性大肠杆菌后，M13的“+”链DNA进入细胞内，以此为模板复制互补的“-”链DNA。由此产生的双链M13DNA称为复制型DNA（RF—DNA）。用双链RF—DNA作为基因载体三、M13噬菌体载体第四节基因重组基因重组：即将目的基因（或外源基因）和载体在体外连接构建形成重组子。这种连接主要靠DNA连接酶。DNA连