微生物检验学之细菌的生物化学试验

细菌的生物化学试验●考点碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源和氮源利用试验各种酶类试验抑菌试验复合生化试验不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定，主要通过这些生物化学试验。一、碳水化合物的代谢试验原理：细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。1.糖（醇、苷）类发酵试验原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。培养基：在培养基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。方法：接种，培养。结果：产酸：培养基中的指示剂呈酸性反应。产气：可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。不分解：培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。2.氧化-发酵试验（O/F试验）（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖而分解蛋白胨的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。（2）培养基HL：Hugh-Leifson培养基。（3）方法：将待检菌同时穿刺接种于两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液状石蜡（或其他矿物油），高度不少于1cm。将培养基于35℃培养48小时或更长。（4）结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加液状石蜡的培养基产酸为氧化型。（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与不发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。3.β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）（1）原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚。（2）试剂：0.75MONPG溶液（3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5分钟，加入0.25mlONPG试剂，水浴20分钟～3小时观察结果。（4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30分钟内显色。（5）应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。4.七叶苷水解试验（1）原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。（2）培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。（3）方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。（4）结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。（5）应用：主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。5.甲基红试验（1）原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。（2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2～4天，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。（4）结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。（5）应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。6.V-P试验（1）原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化为二乙酰，进而与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，则为V-P试验阳性。（2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养48小时后加入甲液（6%α-萘酚乙醇溶液）和乙液（40%KOH溶液），振摇。（4）结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于35℃4小时后仍如故者即为阴性。（5）应用：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验其原理为：不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。具体试验方法有：①明胶液化试验；②吲哚试验（靛基质试验）；③硫化氢试验；④尿素酶试验；⑤苯丙氨酸脱氨酶试验；⑥氨基酸脱羧酶试验。1.明胶液化试验（1）原理：某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。（2）方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22℃培养7天，每日观察结果。若用35℃孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察结果前，先置4℃冰箱内30分钟，再看结果。（3）结果：培养基呈液化状态为阳性。（4）应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。2.吲哚（靛基质）试验（1）原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对位二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。（2）培养基：蛋白胨水培养基。（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养24～48小时，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。（4）结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。3.硫化氢试验（1）原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀。此试验可间接检测细菌是否产生硫化氢。（2）培养基：醋酸铅培养基。（3）方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35℃培养24～48小时观察结果。（4）结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。（5）应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。4.尿素分解试验（1）原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。（2）培养基：尿素培养基。（3）方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃培养18～24小时观察结果。（4）结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。（5）应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性，另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。5.苯丙氨酸脱氨酶试验（1）原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。（2）培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。（3）方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于35℃培养18～24小时，滴加10%三氯化铁试剂3～4滴，自斜面上方流下。（4）结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时间会引起褪色。（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。6.氨基酸脱羧酶试验（1）原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱。使指示剂显示出来。（2）培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。（3）方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液状石蜡或矿物油，于35℃培养1～4天，每日观察结果。（4）结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。（三）碳源和氮源利用试验是细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验。在枸橼酸盐培养基中，细菌只有利用枸橼酸盐作为碳源，分解后生成碳酸钠使培养基变碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深蓝色。常用的试验方法有枸橼酸盐利用试验、丙二酸盐利用试验。1.枸橼酸盐利用试验（1）原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，并且利用枸橼酸盐作为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变为碱性。（2）培养基：枸橼酸盐培养基。（3）方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35℃培养1～4天，每日观察结果。（4）结果：培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌，在此培养基上不能生长，培养基则不变色，为阴性。（5）应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性。2.丙二酸盐利用试验（1）原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生成碳酸钠，使培养基变为碱性。（2）培养基：丙二酸盐培养基。（3）方法：将被检菌接种于上述培养基，35℃培养24～48小时后观察结果。（4）结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。（5）应用：肠杆菌科中属间及种的鉴别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。（四）各种酶类试验1.氧化酶试验（1）原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。（2）试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺。（3）方法：常用方法有以下三种：1）菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。2）滤纸法：取洁净滤纸一小块，蘸取菌少许，然后加试剂。3）试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。（4）结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。为保证结果的准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。2.过氧化氢酶试验（触酶试验）（1）原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。（2）试剂：3%过氧化氢溶液。（3）方法：取菌置于洁净的试管内或玻片上，然后加3%过氧化氢数滴；或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。（4）结果：有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。（5）应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。3.硝酸盐还原试验（1）原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代