分子生物学第五章分子生物学研究法(上)

分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术2cDNA文库的构建3切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆4目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术5基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法6核酸杂交法7培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA印迹32P标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆8免疫筛选法9文库铺于E.coli形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术10SNP概述singlenucleotidepolymorphism,pronounced“snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因11第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展昀早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。RFLP可以测定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。RFLP技术可用于在不同环境中微生物多样性的研究。12第二代遗传标记：SSR（微卫星标记）SSRsimplesequencerepeats/STRshorttandemrepeats/micro-satallites均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富微卫星位点通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。13SNP的类型一个SNP表示某个位点一个核苷酸的变化14CGTA转换2/3CAAC颠换1/3CH3自发脱氨基作用甲基化胞嘧啶残基C胸腺嘧啶残基TCpG中C最易发生该突变单倍型一个人类个体大约携带300-1000万个SNP单倍型：位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点相邻SNP的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代15AGGT染色体A染色体A’SNP1SNP2AGTG染色体A染色体A’SNP在基因组中的位置基因编码区cSNP比例小，占1/5同义cSNP（不影响翻译蛋白质）非同义cSNP（影响蛋白质功能），导致生物性状改变，影响大基因调控区pSNP影响基因表达量，影响大基因随机非编码区rSNP影响不大16SNP的例子：玉米储藏蛋白的3种单倍型单倍型基因型外显子IV内含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT17同一种蛋白质的八种基因型包括三个单倍型H1H2H3其中H1H2至少含3个SNPH3含4个SNP目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术18SNP的检测技术DNA测序法检测新的SNP基因分型利用数据库中已有SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究检测技术基因芯片技术Taqman技术分子信标技术焦磷酸测序法19基因芯片技术20待测基因样品经PCR扩增并标记探针固定在基膜上探针DNA探针与目的基因杂交通过显色信号的分布判断样本信息在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法Taqman技术21荧光供体探针荧光受体荧光对目的基因进行PCR反应，在反应系统中加入Taqman探针若Taqman探针与目的基因结合，PCR反应有效进行后，探针会被Taq酶切割，使得荧光恢复若Taqman探针与目的基因不结合，PCR进行后，探针也不会被Taq酶切割，供体荧光依旧被猝灭分子信标技术（分子导标技术）22荧光供体荧光受体荧光探针分子信标是茎环结构的荧光标记的寡聚核苷酸，环状区与靶序列特异结合若分子信标与目的基因结合，荧光恢复若分子信标与目的基因不结合，自由的分子信标呈现茎环结构，供体荧光被猝灭焦磷酸测序法适用于已知序列的DNA片段的验证分析适用于已知SNP的序列验证及基因分型四种酶催化同一反应体系的酶级联反应酶：DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶、双磷酸酶其它：APS、萤光素待测序的DNA单链和测序引物23焦磷酸测序法24PiAMPADPATPPPidNMPdNDPdNTPATP、ATPPPiAPSPPiDNAdNTPDNA1nn双磷酸酶双磷酸酶氧化荧光素萤光素酶萤光素硫酸化酶聚合酶酶级联反应降解反应发出与ATP量成正比的光信号焦磷酸测序法每次只加一种dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP或dGTP)，等待酶级联反应如果加入的是正确的dNTP,产生光信号如果加入的不是正确的dNTP,不产生光信号用dATPαS代替dATP，是因为dATP会干扰酶级联反应，而且其活性也更高ATP和未渗入的dNTP由双磷酸酶降解，猝灭光信号，并再生反应体系25目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术26SNP的应用人类基因单体型图的绘制SNP与疾病易感基因的相关性分析指导用药与药物设计27目录RNA操作技术SNP的理论与应用基因克隆技术RACE技术应用cDNA差示分析法克隆基因Gateway大规模克隆技术基因的图位克隆法蛋白质与蛋白质组学技术28基因克隆技术分子生物学中的克隆将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得到永久保存和复制的过程克隆的DNAcDNA克隆技术RACE应用cDNA差示分析法克隆基因Gateway大规模克隆基因基因的图位克隆法29RACERapidamplificationofcDNAends在已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列的技术依赖于RNA连接酶连接和寡聚帽子的快速扩增305’-RACE311.在反转录酶的作用下，用已知基因片段内部特异引物GSP合成cDNA第一条链2.用Rnase降解mRNA并纯化cDNA第一条链3.在末端转移酶的作用下，在cDNA链3’端合成寡聚C4.以连有寡聚G的锚定引物和GSP2进行PCR扩增，以期得到目的基因5’端片段并检测3’-RACE32a.在反转录酶的作用下，以连有寡聚T的锚定引物AP起始cDNA第一条链的合成b.用Rnase降解模板mRNAc.用锚定引物AP和基因片段内部特异引物GSP进行PCR扩增，以期得到目的基因3’片段，并进行检测目录RNA操作技术SNP的理论与应用基因克隆技术RACE技术应用cDNA差示分析法克隆基因Gateway大规模克隆技术基因的图位克隆法蛋白质与蛋白质组学技术33应用cDNA差示分析法克隆基因没有任何探针的情况下，克隆控制某一特定性状或生理反应中间步骤的基因利用PCR能以指数形式扩增双链DNA模板，仅以线性形式扩增单链模板的特点通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段34应用cDNA差示分析法克隆基因35mRNAcDNA四碱基内切酶消化加12/24碱基接头加温去掉12碱基短链PCRTesterDriver去掉原接头，连上新接头去除原有接头1:100杂交指数扩增Tester-TesterTester-Driver线性扩增Driver-Driver无扩增目录RNA操作技术SNP的理论与应用基因克隆技术RACE技术应用cDNA差示分析法克隆基因Gateway大规模克隆技术基因的图位克隆法蛋白质与蛋白质组学技术36Gateway大规模克隆技术传统的酶切连接方法不能满足大规模克隆的需要大规模克隆需要高效的对载体和宿主没有依赖性的克隆系统Gateway大规模克隆发利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现快速克隆和载体间平行转移Gateway克隆技术包括TOPO反应和LR反应两步37TOPO反应38将目的基因PCR产物连入Entry载体1、Entry载体上的CCCTT被拓扑异构酶识别，TOPO偶联在载体上2、PCR产物末端的GTGG与载体上的接头序列CACCLR反应39将目的片段从Entry载体中重组入表达载体Entry载体上基因两端有attL1和attL2,目的载体上含有attR1和attR2在重组蛋白的作用下，定向重组形成新位点attB1和attB2目录RNA操作技术SNP的理论与应用基因克隆技术RACE技术应用cDNA差示分析法克隆基因Gateway大规模克隆技术基因的图位克隆法蛋白质组与蛋白质组学技术40基因的图位克隆法分离未知性状目的基因的好方法步骤构建遗传连锁图，将目的基因定位到染色体的特定位点，并在两侧做标记通过大量内切酶和杂交探针的分析，找出离目的基因昀近的标记用染色体步移技术将位于两个标记之间的基因片段克隆并分离出来41目录RNA操作技术SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术双向电泳技术蛋白质质谱分析技术42蛋白质组与蛋白质组学技术蛋白质组学技术蛋白质和基因组研究的组合致力于研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱与基因组的区别：不同器官、组织或细胞内拥有不同的蛋白质组43双向电泳技术44（1）蛋白质混合物（2）在窄的胶上用等电聚焦电泳分开等电点不同的蛋白质（3）将窄的胶放在SDS-PAGE大胶边上，再加上垂直方向的电场，应用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺）将不同分子量的蛋白质分开；SDS带有大量负电荷，使得蛋白质的电荷可忽略目录RNA操作技术SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术双向电泳技术蛋白质质谱分析技术45蛋白质的质谱分析技术质谱仪分为三部分离子源、离子分析区和检测器质谱仪的种类MALDI-TOF基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱ESI-MS电喷雾质谱46MALDI-TOF47MALDI-TOF蛋白质酶解成小肽段后与基质混合将样品混合物点到金属靶表面上并使之结晶干燥用激光轰击，将呈离子化气体状态的待分析物从靶表面喷射出去离子化的气体肽段被加速后到达检测器的时间由m/z（质荷比）决定得到不同质荷比离子化肽段到达检测器的时间绘出质谱图，与已有肽指纹图谱比较48ESI（电喷雾质谱）49毛