生物化学实验基本技术解读

生物化学实验基本技术第一节生物大分子的基本制备技术一、盐析（Salting–out）技术定义：蛋白质在高浓度盐的溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。影响因素：1.盐的种类2.盐的浓度3.pH值4.温度5.蛋白质浓度二、透析和超滤(DialysisandUltrafiltration)1.透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜而进行纯化的一种方法。2.超滤是利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。第二节分光光度法一、基本原理当一束白光通过一杯有颜色的溶液时，具有一定波长的光线选择性的被溶液所吸收。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度。其理论依据是郎伯—比尔(Lambert-Beer)定律。A=KCL二、分光光度计的结构原理三、几种常用的国产分光光度计（一）721型分光光度计（二）UV-754型分光光度计是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。第三节层析技术原理层析技术分类名称操作方式固定相流动相分离依据分配层析纸层析薄层层析液体液体溶解度离子交换层析离子交换柱层析固体液体带电性静电引力吸附层析吸附薄层层析气体吸附层析固体固体液体气体吸附力亲合层析酶与底物抗原与抗体固体液体配体专一性凝胶层析凝胶过滤固体液体分子大小常用的层析原理1.分配层析——纸层析原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（α）。固定相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度固定相：滤纸上吸附的水流动相：有机溶剂（酚）α=纸层析纸层析是最简单的液一液相分配层析。滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，Rf是个常数。2离子交换层析原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基可交换离子：阳离子：Na+、H+阴离子：Cl-、OH-示意图（交换树脂表面）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子示意图水分子B物质A物质3吸附层析原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离子键)、氢键及范德华引力等。在不同条件下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。吸附层析示意图吸附剂易吸附分子不易吸附分子4亲和层析原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。5凝胶过滤原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。第四节电泳技术一、定义：在溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象，称为电泳。淀粉凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳凝胶支持物区带电泳纸电泳醋酸纤维薄膜电泳薄层电泳非凝胶支持物电泳用支持物区带电泳显微电泳等电聚焦电泳等速电泳不用支持物电泳是否用支持物二、电泳技术分类三、电泳技术基本原理1.基本原理不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。pHpI分子带负电荷,在电场中向正极移动;pHpI分子带正电荷,在电场中向负极移动;泳动率u=v=d/t=dleV/lVt2.影响电泳速度的因素(1)电场强度泳动速度与电场强度成正比常压电泳(100—500V).2—10V/cm，几小时或几天；蛋白质等大分子物质;高压电泳(500—1000V).20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质;（2）溶液的pH值pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大；（3）溶液离子强度离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。（4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。四、几种常见电泳的比较类型优点缺点纸电泳设备操作简单分辨率差，电渗现象醋酸纤维薄膜电泳设备操作简单，样品用量少分辨率差琼脂糖凝胶电泳快速，分辨率高电渗现象严重聚丙烯酰胺凝胶电泳可调节凝胶孔径，样品用量少分辨率高，无电渗现象高浓度凝胶难剥离五、聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理1.原理具有电泳和分子筛的双重作用2.聚丙烯酰胺凝胶的聚合单体：丙稀酰胺（Acr）交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis)催化剂聚合形成的三维网状结构。OCH2=CH-C-NH2OOCH2=CH-C-NH-CH2-NH-C-CH=CH2催化剂（1）过硫酸铵-TEMED系统碱性条件下催化作用温度与聚合快慢成正比（2）核黄素-TEMED系统光激发的催化反应用量少，对分析样品无影响聚合时间可自由控制3.聚丙烯酰胺凝胶的孔径凝胶越浓T，凝胶孔径↓，所受阻力，机械强度丙稀酰胺浓度分离物质分子量4％大于100万7－7.5％1－100万15－30％小于1万胶的孔径为蛋白质分子平均大小一半时效果好凝胶强度的选择先用7.5%的标准凝胶或4%--10%的凝胶梯度测试4.缓冲系统的选择pH、离子种类和离子强度酸性蛋白质高pH碱性蛋白质低pH连续和不连续系统电泳槽中的缓冲系统和pH与凝胶相同电泳槽中的缓冲系统和pH与凝胶相同，分辨率高（1）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续性A.凝胶层的不连续性浓缩胶T=2.8％C=20%；分离胶T=7％C=2.5%B.缓冲液成分的不连续性：凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl－，电极缓冲液Tris-Gly,Gly－C.pH的不连续性：浓缩胶pH6.7,分离胶pH8.9，电极缓冲液pH8.3D.电位梯度的不连续性（2）盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应样品的浓缩效应电荷效应分子筛效应A.样品的浓缩效应缓冲液成分及pH的不连续性浓缩胶pH6.7缓冲液浓缩胶Tris-HCl,电极缓冲液Tris-Gly解离度：Cl蛋Glymclclm蛋蛋mGlyGly凝胶中Cl－为快离子，Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。缓冲液样品浓缩胶分离胶缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图快离子慢离子蛋白质样品E：每厘米的电压降E＝I(电流强度)/(电导率)E与电泳速度成正比电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性E：每厘米的电压降E＝I(电流强度)/(电导率)E与电泳速度成正比电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：缓冲液成分及pH的不连续性电位梯度的不连续性缓冲液浓缩胶样品分离胶四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液样品浓缩胶分离胶四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。缓冲液浓缩胶分离胶B.电荷效应蛋白质样品进入分离胶后pH增大(pH8.9)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。缓冲液浓缩胶分离胶C.分子筛效应分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。缓冲液浓缩胶分离胶第五节离心技术一、基本原理物体围绕中心轴旋转时会受到离心力F的作用。当物体的质量为M、体积为V、密度为D、旋转半径为r、角速度为ω（弧度数/秒）时，可得：F=Mω2r或者F=V.D.ω2r二、离心技术的应用1.沉降速度离心是指在离心管内液体密度均一情况下进行的离心。2.梯度离心是待分离的物质在具有密度梯度的介质中进行的离心。梯度离心可分为两种，即密度梯度离心（又称沉降速度离心、速度区带离心或差速区带离心）和平衡密度梯度离心（等密度梯度离心和沉降平衡离心）。