基因突变重组与检测技术

基因突变重组与检测技术卫生部北京医院肖飞临床基因扩增实验室检测培训课程目录内容介绍二、基因重组技术三、基因突变的检测方法1.分子杂交技术3.高通量基因测序技术一、基因突变的产生与后果2.基因测序技术目录遗传中心法则回顾转录翻译逆转录复制目录第一节基因突变的产生与后果点突变基因缺失插入基因异位或重排表观遗传学基因突变的种类目录DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因序列的改变一、基因突变的定义┯┯┯┯ＡＴＧＣＴＡＣＧ┷┷┷┷┯┯┯┯┯ＡＴＡＧＣＴＡＴＣＧ┷┷┷┷┷┯┯┯┯ＡＴＧＣＴＡＣＧ┷┷┷┷┯┯┯ＡＧＣＴＣＧ┷┷┷┯┯┯┯ＡＣＧＣＴＧＣＧ┷┷┷┷┯┯┯┯ＡＴＧＣＴＡＣＧ┷┷┷┷增添缺失替换目录基因突变的原因和类型外界因素物理因素化学因素生物因素内部因素DNA修复功能减弱类型原因自然突变人工诱变目录基因突变的特点和意义意义：新基因产生的途径，是生物变异的根本来源，是生物进化的途径。特点普遍性:生物界中普遍存在随机性:可发生在生物个体发育任何时期不定向性：突变无明显偏倚低频性:自然状态下突变频率很低10－5-10-8多害少利性：多数有害,少数有利目录点突变的实例：镰刀型细胞贫血症的形成病人的血红蛋白的一条多肽链发生了什么变化？…－脯氨酸－谷氨酸－谷氨酸—……－脯氨酸－缬氨酸－谷氨酸—…正常异常目录CTTGAA谷氨酸缬氨酸DNAmRNA氨基酸蛋白质正常异常GUACATGTA突变GAA_____原因_____原因根本直接点突变的实例：镰刀型细胞贫血症目录与肿瘤相关的常见点突变类型基因生长因子Sis,α-TGF,生长因子受体Erb(EGFR),HER2/neu,细胞信号传导因子H-,K-,N-ras,src,raf,转录因子N-,c-,L-myc,c-jun,fos细胞周期因子PRAD1(cyclinD)凋亡相关基因bcl-2,bcl-X目录肿瘤突变—取样的特殊性注意事项：必须从肿瘤组织中取样SampleSelectionbyLaserCaptureMicrodissection目录基因缺失基因缺失可以是1-2个碱基，也可以是一个片段甚或一个外显子的缺失。基因片段的缺失可使该基因激活，转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。在肿瘤发生中，多为抑癌基因的缺失。常见的抑癌基因缺失包括：RB-theretinoblastomagenp53genep16-INK4a目录基因插入基因插入多由病毒感染造成。病毒肿瘤人类T-淋巴细胞白血病病毒I型白血病人类巨细胞病毒（CMV）血液系统恶性肿瘤嗜肝DNA病毒肝癌人类乳头状瘤病毒（HPV）宫颈癌EB病毒（EBV）鼻咽癌目录基因异位与重排指细胞基因组中DNA顺序重新排列组合的现象淋巴细胞白血病t(9;22):BCR-ABLt(12;21):TEL-AML1t(1;19):E2A-PBX1t(4;11):MLL-AF4髓细胞白血病Inv(16):CBF-MYH11t(8;22):AML-ETOt(9;22):BCR-ABL5'partnerClass3'partnerTMPRSS2IERGTMPRSS2IETV1TMPRSS2IETV4HERV-K_22q11.23IIETV1SLC45A3IIETV1C15orf21IIIETV1HNRPA2B1IVETV1KLK2IIETV4CANT1IIETV4ACSL3IIETV1SLC45A3IIERGFLJ35294IIETV1DDX5IVETV1TMPRSS2IETV5SLC45A3IIETV5EST14IIETV1HERVK17IIETV1ETV家族常见融合基因目录表观遗传学1.概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。2.特征:(1)可遗传；(2)可逆性；(3)DNA不变3.表观遗传学的现象：(1)DNA甲基化(2)组蛋白修饰(3)MicroRNA(4)Genomicimprinting(5)端粒酶目录表观遗传学——甲基化目录表观遗传学——组蛋白修饰组蛋白（去）乙酰化De/Acetylation组蛋白甲基化Methylation组蛋白磷酸化Phosphorylation组蛋白泛素化Ubiquitination组蛋白糖基化ADP-Rybosilation组蛋白与Swi/Snf复合体的结合Swi/Snfcomplex,which,invitro,usestheenergyofATPhydrolysistodisrupthistone-DNAinteractions多数化学修饰的化学基团可以减少组蛋白的正电性，从而使其与DNA结合变疏松，使染色质结构发生变化。目录表观遗传学——microRNA细胞核内转录后长片段的miRNA（Pri-miRNA)Drosha酶处理70－100个nt的发夹结构的RNA（pre-miRNA）运输到胞质Dicer剪切19－23个nt组成的成熟的miRNA结合到由RNA介导的RISC或类似相同的复合物中，参与RNA干扰，由miRNA和靶基因mRNA的碱基配对引导RISC降解目的片段或是阻碍其翻译过程目录表观遗传学——microRNA50％的miRNAs位于或靠近肿瘤中易发生改变的染色体区域内.常见的断裂位点，靠近或在可能的癌基因或抑癌基因范围内最小扩增区域，可能包含癌基因最小杂合子缺失区域，通常认为抑癌基因定位在这些区域中脆性位点（FRA),FRA是容易发生姐妹染色质交换，易位，缺失，扩增的位点，或者质粒DNA和肿瘤相关病毒易插入位点目录第二节基因重组技术整合基因重组转化（自然）转导转座质粒基因工程BAC（人工）YAC基因重组目录基因重组—整合整合：噬菌体感染大肠杆菌的第一步噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的DNA注入菌体中。此DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。裂解：噬菌体感染大肠杆菌的第二步DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新噬菌体，并将细菌涨破。目录基因重组—转化转化：由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌的转化目录基因重组—转化病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。目录基因重组—转导溶原菌中DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。来源于宿主的基因称转导基因。目录基因重组—转位转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。这些游动的基因称为转位子(transposon)。目录基因工程技术酶目的基因载体基因宿主基本要素基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目录质粒(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。目录克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体目录目的基因1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（见第22章）目录重组DNA技术中常用的工具酶-限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶目录Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG目录BamHⅠGATCTAGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGEcoRVGATATCCTATAGATCTAG+平端切口粘端切口目录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEcoRⅠ切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABglⅡ切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAG+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录pRSFDuet-16042bplaclCK-MT7promoterT7promoterRSForiT7terminatorKanCK-BCK-BEcoRI(1230)NcoI(70)NdeI(1416)XhoI(2567)pESC-Ura13413bpGPDGPDGPDf1oripUCori2-micronoriTADH1TCYC1TCYC1URA3Amp+MFalphaMFaMFaFibrinogenalphachainFibrinogenBetaChainFibrinogenGammaChainEcoRI(6348)HindIII(7711)KpnI(3702)NheI(9811)PacI(2185)SpeI(4695)XhoI(2195)BamHI(5284)BamHI(7029)pcDNA3.1(-)6104bpAmp(R)sGFPSV40pABGHpABGHreverseprimerCMVpromoterSV40earlypromoterblapromoterT7promoterf1originpUCoriginVP16Bax-ZF53NLSBamHI(3583)BstBI(3623)EcoRI(2881)HindIII(1741)PstI(3593)XbaI(916)NheI(896)SmaI(1625)SmaI(2822)XmaI(1623)XmaI(2820)大肠杆菌表达系统酵母表达系统哺乳细胞表达系统几种不同的蛋白表达系统重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱目录目录酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他目录人工染色体染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括自主复制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）着丝粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN)端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）目录人工染色体将3个关键序列用分子生物学方