Premix-Ex-Taq-TM(Probe-qPCR)说明书宝生物工程公司Premix-Ex-Ta

TakaraCode：DRR390APremixExTaqTM(ProbeqPCR)（200次量）宝生物工程(大连)有限公司说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容1●适用的RealTimePCR扩增仪1●保存1●试剂盒原理1●试剂盒特长2●操作注意2●操作方法2◆应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem扩增仪的操作方法2◆应用ABIPRISM7000/7700/7300Real-TimePCRSystem，StepOnePlusReal-TimePCRSystem的操作方法4◆应用ABIPRISM7500/7500FastReal-TimePCRSystem的操作方法5◆应用LightCyclerRealTimePCR扩增仪的操作方法7◆应用SmartCyclerIISystemRealTimePCR扩增仪的操作方法8●PCR反应条件说明9●进行RT-PCR反应时的实验方法9●引物设计说明10●特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务11●问答11●制品说明本制品是采用探针法（TaqMan®，MolecularBeacon等）进行RealTimePCR（qPCR）反应的专用试剂。是一种2×浓度的PremixType试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。Mix中添加了TliRNaseH（耐热性RNaseH），以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。制品中的DNA聚合酶使用了改良后的HotStart法用DNA聚合酶TaKaRaExTaqHS，与Takara精心研制的RealTimePCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的RealTimePCR扩增反应。本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。●制品内容（50μl反应×200次）PremixExTaqTM（ProbeqPCR）（2×Conc.）*11.0ml×5支ROXReferenceDye（50×Conc.）*2200μl×1支ROXReferenceDyeII（50×Conc.）*2200μl×1支*1内含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+,TliRNaseH等。*2只使用在LifeTechnologies、AgilentTechnologies等公司的RealTimePCR扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。使用ABIPRISM7000/7700/7300和StepOnePlusReal-TimePCRSystem使用ROXReferenceDye，7500Real-TimePCRSystem和7500FastReal-TimePCRSystem使用ROXReferenceDyeII，AgilentTechnologies公司的Mx3000P也适用ROXReferenceDyeII。ThermalCyclerDiceRealTimeSystem、LightCycler、SmartCyclerIISystem等RealTimePCR扩增仪时不必使用。●适用的RealTimePCR扩增仪ThermalCyclerDice®RealTimeSystem（Takara）ABIPRISM®7000/7700，7300/7500Real-TimePCRSystem，7500FastReal-TimePCRSystem（LifeTechnologies）LightCycler®（RocheDiagnostics）SmartCycler®IISystem（Cepheid）Mx3000PTM（AgilentTechnologies）其他各种RealTimePCR扩增仪●保存：4℃保存。可在-20℃长期保存，一旦融解请于4℃保存。反复冻融制品性能可能下降，请避免多次反复冻融制品。●试剂盒原理进行PCR扩增时，在PCR反应液中加入荧光探针，然后在PCR扩增过程中，通过检测PCR反应液中的荧光强度，可以达到监测PCR产物扩增量的目的。本制品中的DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRaExTaqHS，并结合Takara独自开发的Buffer系统，可以有效抑制非特异性PCR扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。-1-◆TaqMan探针法TaqMan探针法是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等），3’端带有淬灭物质（如：TAMRA等）的TaqMan探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中，TaqDNA聚合酶的5’→3’Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。具体原理见右图。●试剂盒特长1．适用于RealTimePCR反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。2．是一种2×浓度的PremixType试剂，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、荧光探针、灭菌蒸馏水便可进行RealTimePCR反应，操作简单方便。3．DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRaExTaqHS，可以进行HotStart法PCR反应，再与Takara公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。4．在2×浓度的Premix中，预先添加了耐热性RNaseH（TliRNaseH），可以最大限度抑制以cDNA作为模板进行PCR反应时，由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。●操作注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1.使用制品时，请上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。试剂没有混匀时反应性能会有所下降，本制品不能用振荡器混匀。PremixExTaq（2×Conc.）于-20℃保存时容易形成沉淀，此时，轻轻用手握一会儿或室温放置一段时间后，颠倒混匀可以完全融解。2.溶解后的试剂请于冰上放置。3.本制品中不含有荧光探针等。4.反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。●操作方法◆应用ThermalCyclerDice®RealTimeSystem扩增仪的操作方法请按照ThermalCyclerDice®RealTimeSystem（TakaraCode：TP800）的使用说明书要求进行实验操作。-2-1．热变性2．引物退火/探针与模板的杂交3．延伸反应Polymerase探针杂交荧光物质探针淬灭物质Primer1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度PremixExTaq（ProbeqPCR）（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.5μl0.2μM*1PCRReversePrimer（10μM）0.5μl0.2μM*1荧光探针溶液1μl*2模板2μl*3dH2O（灭菌蒸馏水）8.5μlTotal25μl*1通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度。*2使用的探针浓度，与使用的RealTimePCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，试剂使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。使用ThermalCyclerDice®RealTimeSystem时，通常探针终浓度在0.1～0.5μM范围内进行调整。*3在25μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如果欲使用本制品进行2StepRT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。2）进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20～30秒范围内进行调整，推荐使用30秒的条件。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Repeat：195℃30秒Stage2：PCR反应Repeat：4095℃5秒60℃30秒◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。3）实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。-3-◆应用ABIPRISM®7000/7700/7300Real-TimePCRSystem，StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem的操作方法请按照各种仪器使用说明书要求进行实验操作。1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量使用量终浓度PremixExTaq（ProbeqPCR）（2×）10.0μl25.0μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.4μl1.0μl0.2μM*1PCRReversePrimer（10μM）0.4μl1.0μl0.2μM*1荧光探针溶液0.8μl2.0μl*2ROXReferenceDye（50×）*40.4μl1.0μl1×DNA模板2.0μl4.0μl*3dH2O（灭菌蒸馏水）6.0μl16.0μlTotal20.0μl50.0μl*5*1通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度。*2使用的探针浓度，与使用的RealTimePCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。*3在20μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如果欲使用本制品进行2StepRT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。*4ROXReferenceDye（50×）最终使用浓度是1×。*5根据各仪器推荐反应体系进行调整。2）进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。ABIPRISM®7000/7700/7300Real-TimePCRSystem两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Reps：195℃30秒Stage2：PCR反应Reps：4095℃5秒60℃30～31秒**使用7700时请设定在30秒。使用7000和7300时请设定在31秒。-4-＜StepOnePlus™Real-TimePCRSystem＞Fast操作流程：HoldingStageReps：195℃20秒CyclingStageNumberofCycles：4095℃1秒60℃20秒◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增