生物显微技术进展

生物显微技术进展《组织学和细胞生物学进展》《细胞生物学专题》主要内容一、显微技术发展简史二、普通显微镜和特殊光学显微镜三、光镜切片制作技术四、电子显微镜五、电子显微镜样品制作技术六、生物显微技术的应用一、显微技术发展简史透射电子显微镜扫描电子显微镜光学显微镜一、显微技术发展简史生物显微技术是指在显微镜的观测范围内用生物材料作实验对象的专门技术。主要包括生物的组织、细胞化学，生物切片技术，显微观察，绘图测量及显微摄影技术，显微注射、切割、挑离等操作技术，还包括显微镜及相关设施的使用和保养。1665年，从英国物理学家罗伯特·虎克发现细胞开始，产生了显微技术。罗伯特·虎克：第一位显微技术学家。1.生物显微技术的概念一、显微技术发展简史2.生物显微技术的发展我国伟大科学家墨子早在二千多年前就研究了放大和缩小的作用，即研究了放大的基本原理。中国人戴眼睛已有一千多年的历史，是世界上最早的。因此可以说显微镜是中国人最早发明的。公元1世纪初，在罗马哲学家的笔记中，大自然打磨的奇妙石头被称为“放大器”（magnifier）或“点火石”（burningglasses）。一、显微技术发展简史荷兰人詹森于1590年制造了第一台由二块透镜组成的复式显微镜。一、显微技术发展简史1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。一、显微技术发展简史17世纪中叶，英国的罗伯特·胡克（用自己制造的显微镜观察软木切片，“细胞”）和荷兰的安东尼·冯·列文胡克（制造了只有一片凸透镜的显微镜，放大了300倍）都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。一、显微技术发展简史1695年惠更斯设计成功二片式目镜，这就是至今仍采用的惠更斯目镜。1700～1750年制成了透射光显微镜，利用平面和凹面反光镜使光线自下往上进行照明。1750～1800年发明消色差透镜，制造了具有粗调及微调的调焦机构，并出现了聚光镜，载物台上标本可借助螺杆进行移动。1886年蔡司打破一般可见光理论上的极限，他的发明——阿比式及其它一系列的镜头为显微学者另辟一新的影像天地。1900～1950年出现了波长λ=275纳米的紫外光显微镜，利用它观察生物标本对紫外线的吸收性，并提高分辨率。一、显微技术发展简史19世纪的显微镜最早的显微镜20世纪初期的显微镜近代光学显微镜一、显微技术发展简史1938年，德国工程师MaxKnoll和ErnstRuska制造出了世界上第一台透射电子显微镜(TEM)。MaxKnoll(1897-1969)ErnstRuska(1906-1988)一、显微技术发展简史一、显微技术发展简史1952年，英国工程师CharlesOatley制造出了第一台扫描电子显微镜(SEM)。一、显微技术发展简史1982年，诺贝尔化学奖授予卓越的电镜应用者——英国的分子生物学家克卢格（AKlug）。1986年，瑞典皇家科学院将诺贝尔物理学奖授予电子显微镜的发明者——德国科学家恩斯特·卢斯卡（ErnstRuska，1906-1988）；授予扫描隧道显微镜（STM）的设计者——德国物理学家宾尼希（GerdBinnig，1947-）和瑞士物理学家罗雷尔（HeinrichRohrer，1933-）。一、显微技术发展简史时至今日，按照各种科学领域及研究对象的不同要求，利用不同的光学原理，已设计制造出多种多样的显微镜。一、显微技术发展简史一、显微技术发展简史3.生物显微技术发展的方向技术上将更快地向定量显微术方向发展；在仪器上不论是光学显微镜还是电子显微镜，都将从单一功能的仪器向多功能组合的大型仪器发展；在操作上将在更大程度上引入电子学技术，从而向更高的自动化操作发展；图象分析技术将迅速地在显微技术中广泛的应用；设法解决在超微结构水平上作活体的观察。一、显微技术发展简史二、普通显微镜和特殊光学显微镜1.普通显微镜1）普通光学显微镜的结构普通光学显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源（普通钨丝灯或LED灯）和聚光器（孔径光阑和聚光镜）；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便。二、普通显微镜和特殊光学显微镜1目镜2镜筒3镜臂4粗调焦螺旋5细调焦螺旋6镜座7物镜转换器8物镜镜头9载物台10聚光器11标本推进器12光源二、普通显微镜和特殊光学显微镜被观察物体AB位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实象A’B’。然后此实像再被目镜作第二级放大，成一虚象A’’B’’,人眼看到的就是虚像A’’B’’,。2）普通光学显微镜的成像原理二、普通显微镜和特殊光学显微镜对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。这两个质点之间的距离取决于光源波长A，物镜镜口角α(标本在光轴的一点对物镜镜口的张角)和介质折射率N，它们之间的关系是：式中：N=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角）。镜口角总是要小于180˚，所以sina/2的最大值必然小于1。镜口率＝N‧sinα/2二、普通显微镜和特殊光学显微镜3）普通光学显微镜的基本概念分辨率：能够把两个点分辨开的最小距离。人们肉眼的分辨率一般只有0.2mm，光学显微镜的分辨率为0.2µm，而电子显微镜可达0.2nm，扫描隧道显微镜的分辨率更高。放大倍数：显微镜经多次成像后最终所成像的大小相对原来物体大小的比值。显微镜的总放大倍率为：物镜放大倍率×目镜放大倍率。有效放大：对于某一显微镜来说，在其分辨能力之内的图像放大。此时的图像放大不失图像表面的细节。无效放大：在显微镜分辨能力以外的图像放大。只是放大了图像轮廓，不能放大和分辨图像的表面细节。可见光照明的显微镜分辨率的极限值约为200nm，一般人正常眼的分辨率为0.2mm，使用光学显微镜可以使我们分辨清楚细胞的微细结构细节提高了1000倍，这正是光学显微镜的极限放大倍数，如果再追求更大倍数也只能是空放大（无效放大），并不能使细节更为清晰。二、普通显微镜和特殊光学显微镜景深：又称焦点深度，指在要求成一副清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离。焦长：景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离。色差：又称色像差。可见光不是单色光，它是由波长范围400至700nm的一系列不同波长的光（即不同颜色的光）组成的复合光，不同波长的光在通过透镜时的折射率不同。这样物方一个点，在像方则可能形成一个模糊色斑。球差：是由于透镜表面为球面而产生的像差故而称为球差，或当透镜孔径较大时，由光轴上一物点发出的光束经球面折射后不再交于一点，这种现象叫做球面像差，简称球差。二、普通显微镜和特殊光学显微镜4）不同放大倍数下的组织二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜2.特殊光学显微镜1）荧光显微镜荧光显微镜是利用紫外光或蓝紫光照射被观察样品，使样品中的荧光物质产生荧光，显微镜成像系统借此来显示样品中产生荧光成分的分布、结构和数量。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。荧光显微镜技术是目前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的有力的工具。荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。常用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因与某种蛋白基因融合，在表达这种融合蛋白的细胞中，便可直接观察到该蛋白的动态变化。二、普通显微镜和特殊光学显微镜特点：光源为紫外线，波长较短分辨力高于普通显微镜；•有两个特殊的滤光片；光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。•照明方式通常为落射式。即光源通过物镜投射于样品上。二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜2）激光共聚焦扫描显微镜普通荧光显微镜下，许多来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率降低，当所观察的荧光标本稍厚时，传统荧光显微镜一个难以克服的缺点就显现出来：焦平面以外的荧光结构模糊、发虚。激光共焦点扫描显微镜以激光作为光源，采共轭聚焦原理和装置，对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构。激光共聚焦扫描显微镜的分辨率可以比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4-1.7倍。所谓共聚焦是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一个小点，即它们互相共焦点。改变焦点可获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构出样品的三维结构。激光共焦点扫描显微镜在研究亚细胞结构与组分等方面的应用越来越广泛。二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。二、普通显微镜和特殊光学显微镜3）暗视野显微镜暗视野显微镜的聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜4）相差显微镜光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不同。密度大则光的滞留时间长，密度小则滞留时间短。相差显微镜可将这种光程差或相位差，转换成振幅差。相差显微镜与普通光学显微镜最主要的不同点是在物镜后装有一块相差板，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，所以又使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起夸大作用。最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象,从而表现出肉眼明显可见的明暗区别。由于反差是以样品中的密度差别为基础形成的，故相差显微镜的样品不需染色，可以观察活细胞，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。二、普通显微镜和特殊光学显微镜相差显微镜照明原理二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜5）偏光显微镜偏光显微镜和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。二、普通显微镜和特殊光学显微镜二、普通显微镜和特殊光学显微镜6）倒置显微镜倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。三、光镜切片制作技术切片法徒手切片法石蜡切片法冰冻切片法组织化学制片涂片法压片法离析法整体装片法非切片法三、光镜切片制作技术1.非切片法制片1）整体封藏法一般是体积很小或自身为一薄片的低等动物如无脊椎动物的水螅、草履虫等。或脊椎动物的胚胎材料：如鸡胚、蛙胚等。也可取下某一动物体的某部分器官制成封片的，如昆虫的翅、鸟的羽毛、鱼的鳞片等。鲨鱼的盾形鳞片姜片吸虫三、光镜切片制作技术2）涂片法用于液态组织，如血液，精液和唾液。三、光镜切片制作技术3）铺片法用于很薄的组织，如肠系膜。三、光镜切片制作技术4）压片法一些柔软的材料可夹在玻片或盖片间进行压碎或压开，经染色后进行观察。三、光镜切片制作技术1.切片法制片1）徒手切片法准备：显微镜、镊子、解剖针、刀片、培养皿、载玻片、盖玻片、绸布或纱布、染料。切片：2~3cm的材料一段，用左手大拇指或食指夹住材料，上方突出于手指2~3mm