生物显微技术课件

生物显微技术与电镜技术海洋生物系王庆恒第一篇生物显微制片技术第二篇显微镜与显微摄影第三篇电子显微镜第一篇生物显微制片技术第一章概论第二章生物显微制片的步骤和原理第三章其他切片法第一章概论第一节制片的目的与任务第二节生物制片的分类临时制片按保存时间永久制片活体观察法按制作方法非切片法切片法车轮虫夜光虫羽纹藻变形虫非切片法整体封藏法：昆虫口器、浮游动物涂片法：血液、粪便伸展法：皮下结缔组织、肠系膜磨片法：牙齿、耳石、贝壳压碎法：根尖、果蝇唾液腺分离法：木材纤维（铬酸－硝酸）、肌纤维（KOH-HNO3）切片法石蜡切片法：旋转切片机。周期短、切片薄且能连续切片。但是易使组织发生收缩变脆；不能切大型材料和坚硬、易碎材料。火棉胶切片法：滑走切片机。价格贵；时间长；不能连续切片，切片较厚。但是能防止高温对材料产生的收缩现象；能包埋较大、较硬、较脆的材料。英国Finesse325旋转切片机德国Leica公司SM2000R滑走切片机切片法冰冻切片法：冰冻切片机。周期很短；切片厚切不能连续切片。融化后各细胞易分散而失去相互联系。能很好保存脂肪和酶类，因而适合脂肪、神经组织和组化切片。在医学快速诊断上广泛使用。德国LeicaCM3050S冰冻切片机取材固定洗涤脱水透明浸蜡包埋切片贴片染色封藏第二章显微切片的步骤和原理第一节取材和固定一、杀死、固定和保存的概念杀死：两层含义。一是把用于取材的动物处死；二是使用化学药品，迅速地终结生物组织的生理活性。固定：在杀死的基础上，把组织或细胞按生活的状态固定下来，使在以后的制片过程中不发生任何变化。保存：将固定好的材料浸泡于保存液使其不发生变质。二、取材的要求固定前按需要配制好固定液。材料尽可能新鲜。研究正常结构时，选择健全而有代表性的部位；研究病理结构时，将病变组织同周围正常组织一起采取。切取材料时，动作快而仔细，尽量不要损伤材料。做好记录第一节取材和固定三、固定的理论（一）固定作用的原理化学作用：凝结作用物理作用：沉淀作用（二）固定的目的和理想的固定剂迅速渗透，防止组织自溶和腐败使细胞内各种成分沉淀保存下来，从而保持细胞与生活状态相近似的形态和结构避免组织或细胞发生收缩或膨胀能增加着色能力和媒染能力固定剂同时能作为良好的保存剂对组织有硬化作用，并具一定的坚韧性。但又不能使材料过于坚硬或变得松脆第一节取材和固定第一节取材和固定三、固定象酸性固定象：在酸性固定剂中细胞分裂间期的染色质、核仁、纺锤丝等结构被保存，细胞质固定成海绵质，核质和线粒体被溶解。碱性固定象：在碱性固定剂中染色质、纺锤丝等结构被溶解，核质和线粒体被保存，细胞质固定成透明质状态，植物细胞的液泡也能被保存。四、固定剂单一固定液的种类、性质及其应用酒精、甲醛、冰醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、碘、锇酸混和固定液的种类、性质及其应用Zenken氏液、Bouin氏液、Carnoy氏液等等第一节取材和固定A.酒精性质：液态，挥发性，优点：渗透力强；固定时间短；具脱水功能；70%酒精可兼做保存剂缺点：材料收缩*还原剂，易被氧化；不宜与铬酸、重铬酸钾或锇酸等配合使用；常与甲醛、冰醋酸、丙酸等配合使用。B.甲醛（福尔马林、蚁醛）性质：气体，常见的为其水溶液，挥发性，优点：渗透力强；对磷脂有保存作用缺点：材料收缩；固定易过度*还原剂，易被氧化；不宜与铬酸或锇酸等配合使用；常与酒精等配合使用。C.冰醋酸，冰乙酸性质：液体，挥发性。优点：渗透力强；对蛋白有保存作用缺点：材料膨胀*宜与铬酸、酒精、甲醛等配合使用。D.苦味酸性质：三硝基苯酚（淡黄色结晶）饱和水溶液优点：渗透力强，沉淀蛋白质，核蛋白，核酸，一般不再溶解缺点：材料收缩*常与冰醋酸配合使用，固定后不能用水洗涤，用酒精洗涤E.铬酸性质：三氧化铬（红棕色结晶）的水溶液，强氧化剂优点：沉淀蛋白质，核蛋白，核酸，一般不再溶解缺点：材料收缩，渗透力弱，固定时间长*不宜与还原剂类的固定剂配合使用F.重铬酸钾性质：橙色晶体，强氧化剂优点：调节不同的pH值可得到两种固定象缺点：渗透力弱，固定时间长*强氧化剂，不宜与还原剂类的固定剂混合使用。G.氯化汞性质：无色粉末，剧毒优点：渗透力强，对蛋白质有强烈的沉淀作用缺点：材料收缩*常与甲醛、冰醋酸、丙酸等配合使用。用碘除汞H.碘性质：棕红色晶体优点：渗透力强，野外使用方便缺点：易挥发，标本不能长期保存*溶于碘化钾溶液配置固定液；使用时可与福尔马林配合使用。是低等单细胞生物、浮游生物的良好固定液I.锇酸性质：灰黄色结晶，强氧化剂，剧毒优点：目前最好的固定剂之一，脂类物质唯一的固定剂缺点：渗透力弱，组织固定不均匀，价格昂贵*取材较小，固定后用过氧化氢漂洗一、洗涤的目的和原则洗涤的目的：将组织间隙中的固定剂清洗干净以免妨碍染色或使材料在后续处理中变质。洗涤的原则:1.固定剂为酒精，或酒精混合物，一般不要求冲洗，如有必要，必须采用与固定剂中的酒精浓度相同或相近的酒精。2.凡是含有铬酸、重铬酸钾、锇酸的固定剂，必须用流水冲洗，冲洗时间应等于或多于固定时间。3.如固定液中含有氯化汞，应根据溶液的性质用水或酒精冲洗，冲洗完毕必须在70%酒精中加碘液去汞。4.含有苦味酸的固定剂，宜选用70%的酒精进行洗涤。苦味酸的黄色在70%酒精中能自行脱去,或加入碳酸钾饱和水溶液除去。第二节洗涤和脱水二、脱水目的：使组织中的水分完全去除，并使组织硬化脱水剂：酒精、丙酮、甘油、正丁醇、叔丁醇、二氧六圜酒精脱水，如需过夜，应停留在70％酒精中丙酮脱水力和收缩作用都较酒精强甘油常用于藻类、菌类和柔弱材料脱水，特别在整体制片法中应用广泛正丁醇、叔丁醇、二氧六圜均为石蜡溶剂，用其脱水后的材料不需要透明，可直接浸蜡目的：使组织中的酒精或者丙酮被透明剂替代，使石蜡可以顺利的进入组织中，或增强组织的折光系数，并能和封藏剂混和进行封藏。透明剂：二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油、丁香油第三节透明及透明剂a.二甲苯优点：作用迅速缺点：易使材料发生收缩变脆b.甲苯优点：材料不易变脆缺点：渗透较慢c.苯优点：对组织收缩少缺点：有毒，易挥发；易爆炸；渗透慢d.氯仿优点：不易使组织变脆，极适于大块材料缺点：透明速度慢e.香柏油优点：对组织的收缩和硬化程度最小缺点：透明速度很慢，不易为石蜡代替f.丁香油优点：渗透快，透明时间短缺点：易使组织变脆；蒸发太慢不易干燥利用石蜡将透明剂去除，使石蜡完全浸入细胞的每个部分，同时使石蜡与材料成为一个整体而便于切片。一般使用熔点在52－56℃，结构细致、光滑而均匀的石蜡。实际使用时，将不同熔点的石蜡混和使用，也可加入少量蜂蜡。由于新石蜡质地疏松，需要将其放在容器中进行长时间煮炼，变得紧密并去除空气和水。同时，用四层纱布过滤去杂质。第四节浸蜡与包埋一、蜡块的修整与固着二、切片过程（一）切片机：旋转切片机（二）切片刀通常分为平凹型、双平型、双凹型。切片刀的角度，一般以5－8度为宜。三、石蜡切片时常见问题、原因及补救第五节切片贴片剂－－蛋白甘油一、配制方法新鲜鸡蛋打孔，倒出蛋白。加入等量甘油和少许防腐剂。用力搅动将蛋白打散后，洗纱布过滤放冰箱备用。二、注意事项少量蛋白甘油即可。展片时，温度不能过高。第六节贴片一、染色剂染色剂的作用：使组织与组织间各部分显现出不同的颜色，达到镜检的效果。二、染色剂的种类碱性染料天然染料按化学性质分中性染料按来源分酸性染料人工染料胞核染料按染色对象分胞浆染料脂肪染料第七节脱蜡与染色三、常用染色剂碱性染料：苏木精、洋红酸性染料：酸性品红、苯胺蓝、刚果红、橘黄G、甲基蓝、伊红、苦味酸中性染料：瑞氏染色粉、姬姆萨染色粉脂肪染料：苏丹红、苏丹黑、油溶蓝第七节脱蜡与染色四、染色过程中使用的其他辅助试剂a.媒染剂有的染料不能直接使细胞或组织着色。媒染剂通常能在水中电离金属离子（金属盐类或金属氧化物）而与染料结合成有色复盐（不溶于水或酒精）使用方法（1）媒染剂与染色剂通常分开配置，切片先浸入媒染剂后移入染色剂；（2）两者混合，产生可溶性复盐，与组织结合后形成新的复盐；（3）混合时加入酸溶液，先阻止复盐产生，染色后再去酸。第七节脱蜡与染色b.固色剂防止组织块或切片脱色，染色后可浸入固色剂中，如氢氧化钙，钼酸铵等。c.漂白剂锇酸或铬酸处理过的样品往往变黑，难以染色，可在冲洗后或染色前使用过氧化氢漂白。d.分色剂使不该着色的染料去掉，使结构着色对比清晰，碱性染料常用盐酸，醋酸和丁香油作分色剂；酸性染料常用硫酸或微带碱性水作分色剂第七节脱蜡与染色封藏剂的选择：透明，折光率高，干燥后能凝固常用封藏剂：中性树胶、甘油胶、糖浆第八节封藏第二篇显微镜与显微照相术第一章概论第二章光学透镜第三章显微镜的光学原理第四章显微镜的基本光学参数第五章显微镜的主要光学部件第六章显微镜的使用及其注意事项第七章各种显微镜第八章显微镜几种常用的附件第九章显微照相术第一章概论第一节光学显微镜的发展历史1590年制造出第一台原始的显微镜。1610年，意大利伽利略制造了具有物镜、目镜和镜筒的复式显微镜。1611年，开普勒阐明了显微镜的基本原理。1625年，法布尔首先提出显微镜（microscope）一词。1665年，英国罗伯特·胡克，制造出能放大140倍的显微镜。不久，荷兰的安东尼·范·列文虎克制作出放大率达270倍的显微镜，实现了历史性的发明。1684年前后，荷兰学者惠更斯设计并制造出结构简单且效果较好的双透镜目镜――惠更斯目镜19世纪中叶，恩斯特·阿贝提出了显微镜的完善理论。1902年，艾夫斯奠定了现代双目镜的基本系统。1941年在德国的蔡司公司制造出第一台相差显微镜。60年代中期研制出诺尔曼斯基微分干涉显微镜，80年代后期研制出激光共聚焦扫描显微镜。第一章概述第二节显微镜的分类光学显微镜单式显微镜电子显微镜复式显微镜一、单式显微镜放大镜，10×以下；解剖显微镜，一般200×以下二、复式显微镜由两组以上透镜组成，具有目镜、物镜、集光器等光学系统。包括实验室常用的显微镜、暗视显微镜、相差显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。各式解剖镜第二章光学透镜第一节透镜的类型透镜：由两个折射面包围一种透明介质形成的光学零件叫做透镜。透镜是光学仪器的核心部分，是显微镜中最重要的组成部件。按透镜的性质分：1.凸透镜：又称为会聚透镜或正透镜，是一种能使光线向光轴靠拢的透镜。它中间厚，边缘薄，或其中一面为球面而另一面为平面。2.凹透镜：又被称为发散透镜或负透镜，是一种能使光线向光轴散开的透镜。其特点为边缘厚而中间薄，或其中一面为凹面而另一面为平面。F′F′典型的凹凸透镜第二章光学透镜第一节透镜的类型按透镜的复杂程度分：1.单透镜：只由两个球面或其中有一面为平面构成的透镜2.复透镜：由两个或两个以上的单透镜胶合而成的透镜。最常见的是由两块单透镜胶合而成的双胶合透镜。3.透镜组：由两个或两个以上相互隔开一定距离的单透镜或复透镜组成的系统称透镜组。第二章光学透镜第二节凸透镜成像显微镜的物镜、目镜和聚光镜都是由多个单透镜或复透镜组成的透镜组，但其实质上只相当于一个凸透镜。凹透镜所成的像总是缩小的虚像，在显微镜上不能单独使用。凸透镜的成像规律为：若u2f，则2fvf，异侧倒立缩小的实像若2fuf，则v2f，异侧倒立放大的实像若u=f，则v→∞，不成相若uf，则同侧正立放大的虚像第二章光学透镜第三节透镜的像差某一物点发出的光束，经过透镜以后，仍然是同心光束，还都会聚在一点，由这种方式形成的像点称为理想像点。由理想像点构成与原物形状、颜色完全相似的像，称为理想像。实际上，从一点发出的光束在通过透镜后并不完全会聚于一点，而是分布在空间一个很小的区域内，成为一个模糊的斑点或称弥散圈。同样，一个物体通过透镜后也不可能形成一个与原物体完全相似的像。造成这些缺陷的主要原因是透镜本身存在的各种像差。第二章光学透镜第三节透镜的像差单色相差轴上点的单色像差――球差慧差像散轴