细胞生物学实验-——步骤集

细胞生物学实验——步骤集PEG促细胞融合法的步骤（1）取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液。（可在4℃保存）（2）取(1)1ml+4ml0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理：①.1200r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液）②.1000~1200r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液）③.1000~1200r/min离心7分钟。（3）将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1~0.2ml），加入GKN液至1~2ml，使之成10%的细胞悬液。（4）取上述10%的血球悬液1ml，加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个，即。（5）取（4）1ml+0.5ml50%的PEG液，或取（4）0.5ml+0.5ml50%的PEG液，或取（4）0.5ml+1.0ml50%的PEG液，混匀滴片，在常温下2~3分钟后，镜下观察。【细胞凝集反应实验步骤】•1.取土豆去皮块茎2克，加10mlPBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗体液中即含有可溶性土豆凝集素。•2.抽取兔子静脉血（加抗凝剂）1ml，加生理盐水3ml，在1000r/min条件下，离心5分钟。重复三次离心，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%的红细胞悬液。•3．分别用滴管吸取土豆凝集素和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片的左孔内，充分混匀。•4．同时分别用滴管吸取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片右孔内，充分混匀，作对照实验。•5.摇晃5-10分钟后，观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。实验步骤—苏丹Ⅲ染色法1.断头法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，并在其下部置一载玻片，用剪连同盖玻片和其上粘的肠系膜取下，滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定20分钟。2.吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。3.用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。4.用苏丹Ⅲ染色30分钟。5.吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，显微镜观察。原代细胞(脾细胞）培养步骤1.取材：取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。转入无菌玻璃培养皿中，待用。2．分离脾细胞：用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1～2分钟。吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000转/分离心1～2分钟。3．培养脾细胞：超净洁净台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞生死状态的鉴别——台盼蓝（TrypanBlue）法（1）试剂配制：用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。（2）细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液l～2ml,静置3～5min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。（3）染色制片：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。（4）染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。•或者，（3）染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2～5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。在普通光镜10X物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。（4）根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：II.伊红Y（EosinY）法（1）试剂配制：用生理盐水配制0.15%伊红染液，备用。（2）细胞悬液制备：将生长有悬浮型细胞的培养瓶（皿）稍微倾斜，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。（3）染色制片：取上述细胞悬液少许，然后加入其等体积量的0.15%伊红染液，混合，2min后制成临时装片，镜检或计数。（4）染色结果：死细胞染成桃红色，活细胞不着色。III.美蓝（MethvleneBlue）染色法（1）试剂配制：用蒸馏水配制0.1%美蓝染液，备用。（2）染色制片：在干净的载玻片中央加一小滴0.1%美蓝染色液，然后再加一小滴酵母菌悬液，混合均匀，染色3～5分钟后从液滴侧面盖上盖玻片并吸去溢出的液体，制成水浸标本片，镜检或计数。（3）染色结果：死酵母菌细胞染成蓝色或淡蓝色，活酵母菌细胞不着色。细胞生死状态的鉴别a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中的细胞数量，再换算成每毫升液体中细胞的数量。每毫升液体中细胞的数===每个大方格中的细胞数量╳10000╳稀释倍数叶绿体分离的步骤1.选取新鲜嫩滤菠菜叶,去叶梗及粗脉,洗净擦干，称30克放于150ml0.35M.Nacl溶液中；2.将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆3–5分钟，转速5000r/min；3.将匀浆用纱布(6层)过滤于500ml烧杯中；4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min；5.取上层清液在3000r/min下离心5(沉淀为叶绿体和细胞核混合物)；6.将沉淀用2-3ml0.35Mnacl液悬浮；7.取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下观察；8.另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%的吖啶橙染料，混匀，盖上盖片，在荧光显微镜下观察。小白鼠肝细胞线粒体超活染色的步骤1、用断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝组织，选取边缘较薄的肝组织0.5cm3，放入小烧杯中，用Ringer液冲洗去血污。2、在干净的凹面载玻片的凹穴中,滴加1/5000詹纳斯绿B溶液，再将肝组织块移入染液中，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(—般需染20～30min)。3、吸去染液，用眼科剪将组织块着色部分剪下重置小烧杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，用剪刀充分剪碎制悬液。4、取上述细胞悬液滴片，加盖玻片，高倍镜下观察。结果：肝细胞质中的线粒体被染成蓝绿色（黄绿色）。小白鼠染色体标本制作步骤1.取雄性小鼠以每克体重4μｇ注射秋水仙素，经14～16小时后，断头法杀死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl）洗去血污。2.放入装有1ml0.3%KCl液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。3.用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml。4.37℃静置30分钟，进行低渗处理。5.以800～1000转/分离心8分钟。6.弃上清液，加入2ml甲醇·冰醋酸固定液（3：1），并用吸管至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8分钟。7.再以800～1000转/分离心8分钟。8.弃上清液，加1ml固定液，再制成细胞悬液，固定5分钟。9.取洁净的低温预冷载片，距载片10～15cm高度滴下2～3滴细胞悬液，从载片一边向另一边轻轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。10.用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥或成文火干燥。染色体标本染色与观察用Giemsa染色20～30分钟，细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。人外周血染色体标本制备(一)细胞培养1．培养基的配制：在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：RPMI-164084ml小牛血清15mlPHA3支肝素钠1ml卡那霉素终浓度为100单位/ml以5%NaHCO3(无菌)或1NHCl调pH至7.2-7.4。用刻度吸管将培养液分装入培养瓶(10ml/瓶)，4℃备用。2．采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血0.3-0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30-40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。3．培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。4．秋水仙素处理：终止培养前2-4小时，在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml)。以上步骤均需无菌操作。(二)染色体制备1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8-10分钟，弃上清液。2．低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低渗15-25分钟。3．预固定：低渗后加入0.5mlCarnoy’s固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8-10分钟。4．一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。5．二固定、三固定：同一固定。6．制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。7．滴片：吸取细胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干。8．染色：1:10Giemsa染色5-10分钟，细水洗去多余染液，气干。9．镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。染色体组型实验的步骤•1.选择染色体清晰的照相底片，用放大机制作出放大10倍的清晰照片。•2.将染色体逐一剪下，并对每个中期染色体逐一进行测量，包括每条染色体的长度和每个臂的长度。•3.根据测量数据，计算出每对染色体平均的相对长度、臂指数与着丝粒指数。•4.把相对长度与臂指数相近者配成一对。•5.参照相对长度、臂指数与着丝粒指数的数值，并根据标准顺序，编排出染色体组型图。•6.用胶水或浆糊将每条染色体依照标准顺序粘贴在实验报告纸上。人类体细胞染色体的分类标准及其主要特征小鼠的转基因技术录像•Procedure1.Dissectionofoviducts.Recoveryoffertilizedeggs.Removalofcumuluscells.•Procedure2.Recoveryof8-cellembryos.Removalofthezonapellucida.Constructionofaggregationchimeras.•Procedure3.Dissectionofuteri.Recoveryofblastocycsts.•Procedure4.DNAinjectionintopronucleitoproducetransgenicembryos.•Procedure5.Nucleartransfer.•Procedure6.Blastocystinjectionofembryonicstemcells.•Procedure7.Vasectomizingmalemice.•Procedure8.Oviducttransferofmanipulatedembryos.•Procedure9.Vterinetransferofmanipulatedembryos.•Procerdure10.Recoveryof6.5and7.5dayembryos.