酶动力学方法

酶学性质研究1.化合物对酶可逆性抑制测定1.1大体积稀释法将侧活体系所需浓度的酶与10倍IC50浓度的化合物孵育30Min,以使化合物与酶充分作用。同样浓度的酶与同样体积的化合物的溶剂孵育，作为对照；孵育结束后，将上述混合物100倍稀释至反应溶液（此时，酶浓度至测活浓度，化合物浓度至0.1倍IC50)；加入底物启动反应，检测酶促-时间曲线；比较实验样品与对照稀释后的酶促曲线。1.2透析法将酶与高浓度的化合物孵育足够的时间，以使酶活性被充分抑制。孵育结束后，将上述混合液到大体积反应溶液充分透析，对照样品以同样的方法透析；透析完全后，测定蛋白浓度和酶活性；比较实验样品以及对照样品透稀前后的酶比活性；根据透稀前后的酶比活性的恢复情况，确定抑制剂的可逆性。2.化合物抑制类型研究2.1Km值和kcat测定测定不同底物浓度时，酶促反应的初速度。对测得的反应速度与相应底物浓度进行回归分析，求得Km值。计算公式为米氏方程（Michaelis-Mentenequation）：=Vmax*[S]/(Km+[S])（公式1），代表反应初速度，Vmax代表最大反应速度，[S]代表底物浓度。此运算可同时得到Vmax。根据公式Vmax＝kcat*[E]（公式2）计算kcat；其中，Vmax为最大反应速度，在计算Km值时求得；[E]为酶浓度3.可逆性抑制剂抑制类型测定3.1竞争型抑制剂通过不同浓度抑制对酶的Km，Vmax变化趋势的影响，可以初步确定抑制类型。随抑制剂浓度的增加Km增大，Vmax基本不变。最后，利用双倒数作图确认抑制剂性质，即在不同抑制浓度条件下，底物浓度倒数（1/[S]）对相应反应速度倒数(1/[V])做图。不同浓度的抑制剂对应的拟合直线交于Y轴同一点。3.2非竞争型抑制剂通过不同浓度抑制对酶的Km，Vmax变化趋势的影响，可以初步确定抑制类型。随抑制剂浓度的增加Km基本不变，Vmax降低。最后，利用双倒数作图确认抑制剂性质，即在不同抑制浓度条件下，底物浓度倒数（1/[S]）对相应反应速度倒数(1/[V])做图。不同浓度的抑制剂对应的拟合直线交于X轴同一点3.3反竞争型抑制剂通过不同浓度抑制对酶的Km，Vmax变化趋势的影响，可以初步确定抑制类型。随抑制剂浓度的增加Km降低，Vmax降低。最后，利用双倒数作图确认抑制剂性质，即在不同抑制浓度条件下，底物浓度倒数（1/[S]）对相应反应速度倒数(1/[V])做图。不同浓度的抑制剂对应的拟合直线平行