第二章--基因工程制药

第二章基因工程制药2.1概述1982年第一个基因重组产品——人胰岛素在美国问世，吸引和激励科学家利用基因工程技术研制新产品。迄今，30余种基因工程药物投入市场，产生巨大经济和社会效益。生物技术用于疾病的预防和疑难杂症的治疗已经成为现实。2.1.1利用基因工程技术生产内源生理活性物质糖尿病：胰岛素侏儒症：人生长激素其它内源性生理活性物质：激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类及凝血因子等来源困难技术尚未解决造价高利用基因工程技术获得上述活性物质成为可能2.1.2基因工程药物种类免疫球蛋白：抗原和单克隆抗体细胞因子：干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、表皮生长因子、凝血因子激素：胰岛素、生长激素、心钠素酶类：尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶2.1.3利用基因工程生产药品优点可大量生产过去难以获得的生理活性物质和多肽，为临床使用提供有效的保证可提供足够数量的生理活性物质，便于对其生理、生化和结构进行深入研究，扩大这些物质的应用范围可生产更多的内源性生理活性物质对内源性生理活性物质使用中出现的问题可以通过基因工程进行改造可获得新型化合物，扩大药物筛选范围2.1.4我国基因工程药物研发现状1997年生产得到α1b干扰素上游技术落后3－5年下游技术（工程菌大规模发酵技术、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等）落后15年2.2基因工程药物生产过程上游技术：目的基因分离、工程菌（细胞）构建在实验室完成下游阶段：工程菌（细胞）大规模培养直到产品分离纯化和质量控制等。2.3目的基因获得反转录法反转录-PCR法化学合成法筛选新基因方法：编码序列富集法、岛屿获救PCR法、动物杂交法、功能克隆法、构建cDNA文库、差异显示技术等对已发现基因改造基因修饰技术定点突变技术目的：提高基因表达产物的稳定性，提高体内半衰期、提高表达产物生物学活性、降低有效使用剂量或提高表达量、降低毒性和免疫原性2.4基因表达目的基因表达产量表达产物稳定性产物生物学活性表达产物分离纯化2.4.1宿主应满足条件具有高浓度、高产量、高产率能利用廉价原料不致病、不产生内毒素发热量低，需氧低，适当温度和细胞形态容易进行代谢调控容易进行重组DNA技术产物容易提取纯化2.4.2宿主分类原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌真核细胞：酵母、丝状真菌大肠杆菌优点：研究较为深入缺点：不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取时需将细胞破碎，造成提取困难分泌能力不足，真核蛋白常形成包涵体，表达产物须经变性复性才能恢复其生物学活性不存在翻译后修饰，只能适用于表达糖基化等枯草芽孢杆菌优点：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养基中不形成包涵体缺点：不能对蛋白质进行糖基化修饰会产生很强的胞外蛋白酶，可对产物进行不同程度的降解链霉菌优点：非致病，使用安全分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养基中具有糖基化修饰能力变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可作为理想的受体菌已构建一系列有效的载体下游培养工艺成熟酵母优点：遗传背景清楚世代时间短，繁殖迅速，可廉价的大规模培养，无毒性基因操作简单可将表达产物直接分泌到胞外，可简化产物分离纯化工艺能对产物进行糖基化修饰能很好的表达在细菌系统中表达不良的真核基因丝状真菌优点：有很强的蛋白分泌能力能正确进行翻译后加工，包括肽的剪切和糖基化修饰，而且糖基化修饰与高等真核生物相似安全，有成熟的发酵和后处理工艺当前研究重点加强对宿主菌遗传背景的研究建立合适的克隆载体和DNA导入方法研究清楚影响基因表达的各种因素及相互关系寻找新的适于不同外源基因表达的宿主菌2.4.3大肠杆菌表达载体的要求载体能独立复制具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记具有很强的启动子，且能为大肠杆菌RNA聚合酶识别应具有阻遏子，使启动子受调控，只有诱导时才能转录应具有强的终止子，以便于转录克隆的外源基因，而不转录其它无关基因所产生的mRNA应具有翻译起始信号，以便转录后能顺利翻译影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因剂量外源基因表达效率启动子强弱核糖体结合位点的有效性SD序列和起始密码子的间距密码子组成外源产物的稳定性细胞的代谢负荷工程菌的培养条件如何提高表达产物的稳定性组建融合基因，产生融合蛋白利用大肠杆菌的信号肽或真核蛋白自身的信号肽，以确保真核基因表达产物分泌到胞浆（外源蛋白不易为细菌酶类所降解）中采用位点特异性突变，改变真核蛋白质中二硫键的位置，从而增加稳定性采用蛋白酶缺陷型菌株，减弱表达产物的降解细胞代谢负荷外源基因表达产物为异己物质，对宿主菌有毒性，甚至使宿主细胞死亡大量的外源基因表达产物能打破宿主细胞生长平衡，影响其它代谢过程，影响宿主细胞生长和代谢，而细胞代谢损伤又抑制外源产物合成如何减轻细胞代谢负荷措施1：细胞大量生长时抑制外源基因表达措施2：宿主细胞的生长与质粒的复制分开措施3：表达产物形成不溶于水的包涵体可降低对宿主的毒性真核基因在大肠杆菌中表达的形式融合蛋白优点：蛋白质在菌体内稳定，不易被降解，易实现高效表达缺点：融合蛋白只能作为抗原，所以会影响蛋白的免疫原性，一般不能作为人体注射用药非融合蛋白优点：能较好的保持蛋白原有活性缺点：易被蛋白酶破坏，且非融合蛋白氨基端通常带有甲硫氨酸，在体内用药易引起人体免疫反应分泌表达蛋白优点：蛋白质在外周质稳定，无活性的蛋白分泌时则具有活性，不含甲硫氨酸不易为降解，易实现高效表达缺点：产量不高，信号肽不被切割或者不在特定位置切割2.4.4酵母体系中的基因表达载体载体复制序列：Yep、YRp、YCp、Yip克隆载体：要求同时具备在大肠杆菌和酵母中复制和增殖的能力表达载体：普通表达载体：能方便的引入外源基因表达，对表达产物组成，特别是对其N端氨基酸增减并无严格要求精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有限制性内切核酸酶位点，以利于接入外源基因，并使他在表达和加工后N端氨基酸序列与天然产物相同影响目的基因在酵母中表达的因素外源基因剂量外源基因表达效率启动子分泌信号效率终止序列的影响外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响菌株生长能力强菌体内源蛋白酶较弱菌株性能稳定分泌能力强2.5基因工程菌生长代谢特点菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子合成的综合表现，通常用比生长速率来表征。工程菌培养可通过选用不同碳源、控制补料或稀释速率来控制菌体生长。控制菌体生长对提高质粒稳定性，减少代谢副产物积累，提高外源蛋白产率有重要意义。大肠杆菌的蛋白与菌体量的比值是基本恒定的，而菌体的生长速度也反应了蛋白质的合成速度。通过改变培养条件，会影响菌体的能量代谢和小分子前体的供应，进而影响生物大分子合成和菌体生长。菌体生长与能量关系菌体生长由呼吸控制，各种碳源通过有限的呼吸能力所能提供的最大能量决定了菌体在这种培养基中的最大比生长速率。当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所提供的能量时，由于呼吸链或三羧酸循环的供能不足，使部分乙酰辅酶A通过转化为乙酸来供能，菌体往往产生代谢副产物乙酸。高浓度乙酸可明显抑制菌体生长。乙酸的抑制作用与培养基pH有关，适当提高pH可减少乙酸的抑制作用。分批培养选用不同碳源，补料培养通过控制补料速度，连续培养通过控制稀释速率都能在一定程度上控制菌体生长，从而减少乙酸产生，减少其抑制作用，以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。菌体生长和前体供应关系在基础培养基中添加氨基酸能使菌体比生长速率提高和蛋白质合成增加。菌体中的小分子前体和催化结构是有限的，因而使生物大分子的合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率。基因表达在各个水平的竞争是各个基因不想竞争共同的前体和催化结构的结果。由于工程菌质粒的复制和外源基因的转录、翻译，将加剧上述成分的不足，因此工程菌生长速率往往低于宿主菌，特别是在诱导后，由于外源基因的大量表达，菌体比生长速率下降，甚至生长停止。质粒对菌体生长的影响中等拷贝数质粒（56copy）的工程菌，TCL的一些关键酶及与前体合成有关的酶的相对水平增加，这些酶的基因大多是受终产物反馈调节的，外源基因的复制、转录和翻译引起菌体内前体浓度的降低可能是诱导这些酶浓度增加的原因之一。含高拷贝数质粒（240copy）的工程菌与宿主菌相比，宿主菌大量前体被利用，引起前体不足，从而产生“严谨反应”。严谨反应严谨反应是当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留并合成ppGpp的结果。ppGpp是一个重要的调控因子，其浓度增加会导致RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，从而使游离RNA聚合酶浓度降低，严谨控制的启动子（如rrnA）转录减少。另一种观点认为，ppGpp通过干扰RNA聚合酶与PL启动子的专一识别反应，而不是通过影响RNA链的延伸过程来减少转录的。由于rRNA启动子受“严谨控制”，当菌体内氨酰tRNA链的延伸不足引起“严谨反应”时，rRNA合成减少，这样翻译水平的前体不足通过ppGpp浓度变化来调节核糖体浓度。2.6基因工程菌的不稳定性基因重组菌的稳定性是高水平发酵生产的基本条件基因工程菌的稳定性至少应维持25代以上2.6.1质粒的不稳定性分裂不稳定：是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。产生分裂不稳定因素含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关；两种菌比生长速率差异的大小，主要由于丢失质粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长优势。产生结构不稳定因素质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个启动子的质粒更容易发生缺失。在无同源的两个位点间也会发生缺失。培养条件。质粒不稳定性分析方法将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10－12h，然后随机挑选100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10－12h，统计长出的菌落数。每个样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性。提高质粒稳定性方法（一）选择合适的宿主菌：宿主菌的比生长速率、基因组系统的特性、染色体上是否有质粒与外源基因同源序列等都会影响质粒稳定性。选择合适载体：1）含低拷贝数质粒的工程菌产生不含质粒的子代菌的频率较大，可通过提高增加质粒拷贝数提高稳定性；2）含高拷贝数质粒的工程菌产生不含质粒的子代菌的频率较低，但由于大量外源质粒的存在使含质粒菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，因此再增加拷贝数，会增加含质粒菌的生长负势，对质粒的不稳定性不利；3）对同一工程菌，控制不同的比生长速率可改变质粒的拷贝数。选择压力：1）抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力；2）添加抗生素在大规模生产时可增加成本，且添加容易被水解的抗生素只能维持一定时间。分阶段控制培养：在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免由于基因表达造成质粒不稳定问题的发生，使质粒稳定的遗传，在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。提高质粒稳定性方法（二）控制培养条件：1）提高比生长速率（温度、溶氧、pH、限制性营养物质浓度及有害代谢产物浓度）有利于提高质粒稳定性。由于重组菌对环境的改变比不含质粒的受体菌反应慢，可通过改变培养条件改变两种菌比生长速率，从而改善质粒稳定性。2）重组菌在复合培养基中稳定性较高，且需要保持较高的溶氧，通过间歇供氧和改变稀释率可提高质粒稳定性。固定化：基因重组菌在固定化后，质粒的稳定性及目的基因产物的产率都会有很大提高。2.7基因工程菌中试中试可以得到大量产品供临床实验，也可将中试所得数据供生产设计时参考。主要考虑问题：适合商品化生产的工程菌设计发酵反应器选择反应过程