β-内酰胺酶

β-内酰胺酶—细菌耐药性机制之一柳州市中医院朱胜波β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染治疗最普遍应用的一类抗生素，随着这类药物的广泛使用(特别是滥用和误用)和致病菌的变迁，产生了病原菌对药物的耐药性问题，而且耐药发生率相当高。细菌产生β-内酰胺酶(β-lactamase)是80%病原菌耐药的原因之一，另外约12%和8%病原菌的耐药分别与细菌细胞外膜通透性障碍和靶位的改变有关。本文对细菌产生β-内酰胺酶所致的耐药性作一简要综述，以便采取相应对策以防止耐药性的蔓延。1β-内酰胺酶的特性β-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的灭活酶。细菌产生β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。β-内酰胺酶分为染色体介导酶和耐药质粒介导酶二大类，以其水解对象可分为青霉素酶、头孢菌素酶、广谱酶和超广谱酶四种。质粒是一种密闭环状双股螺旋结构的DNA，存在于胞浆内，也是具有遗传功能的基因成分，质粒带有各种基因，包括耐药基因，但不是细菌存活所不可缺少的组成物质。质粒介导的β-内酰胺酶用等电聚焦法分型有TEM型(TEM-1，TEM-2)，OXA型(OXA-1～3)，PSE型(PSE-1～4)，SHV-1，HMS-1等标准酶，均为G-杆菌，主要为大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、肠杆菌属、绿脓杆菌等产生。TEM型酶分布很广，尤以TEM-1型分布最广，出现频率最高，约占50%。染色体介导酶有K1型，P99型及D31型，染色体基因决定细菌对抗生素固有耐药性，近代研究证明在院内感染病人中产生质粒介导酶的耐药菌，其产生耐药性大多是在接触抗生素后获得的，并通过耐药基因的转移而播散，也可由基因表达而传至下代。至今β-内酰胺酶的数量已超过200种，其中超广谱β-内酰胺酶(extendedspectrumβ-lactamase,ESBL)已超过50种。2β-内酰胺酶的分类Ambler等根据β-内酰胺酶分子结构中氨基酸序列差异，将β-内酰胺酶分成A、B、C、D4种类型。1995年Bush等提出了β-内酰胺酶的功能分类方案，依据酶的底物和酶被抑制不同，将其分为4群，其中2和3群又可分为许多亚群。2.1A型β-内酰胺酶A型β-内酰胺酶按Bush分类法属2群，向下又分为8个亚群(2a,2b,2c,2d,2e,2f,2be,2br)，因此，A型β-内酰胺酶在底物动力学性质上显示多样性。大多数青霉素类抗生素都是A型β-内酰胺酶的良好底物，侧链上有氨基的氨苄西林，含羧基的羧苄西林。侧链上具有空间障碍基因的苯唑西林和甲氧西林都是A型β-内酰胺酶的良好底物。从整体上看，A型β-内酰胺酶对青霉素类的水解率较头孢菌素类为高，但也有例外。此类酶的活性可被克拉维酸等酶抑制剂所抑制。2.2B型β-内酰胺酶B型β-内酰胺酶的活性依赖于2价过渡态金属离子，大多数情况下为Zn2+，此酶不被棒酸抑制，但能被EDTA所抑制，按Bush分类属3群。按照核苷酸序列，此酶可分为2个亚型，一个亚型以L-1酶为代表，另一亚型以A2酶和CcrA酶为代表。L1酶和CcrA酶有相当广谱的底物轮郭，能水解头孢西丁，也有报告可水解氨曲南。亚胺培南是A2酶的唯一底物，因此，A2酶也可称碳青霉烯酶。2.3C型β-内酰胺酶C型β-内酰酶通常被称为头孢菌素酶，按Bush分类法属1群。第1代头孢菌素是C型β-内酰胺酶的良好底物，第2、3代头孢菌素一般对C型β-内酰胺酶不敏感。亚胺培南和氨曲南则表现出对C型β-内酰胺酶的抑制作用。2.4D型β-内酰胺酶D型β-内酰胺酶Bush分类属2d群，它们对苯唑西林和氯唑西林的水解速度明显大于苄青霉素，因此，它们又被称为“苯唑西林酶”。细菌β-内酰胺酶的分类见表1。表1细菌β-内酰胺酶的分类分子类型Bush分类优先底物被抑制代表酶克拉维酸EDTAA2a青霉素+-G+菌产生的青霉素酶A2b青霉素头孢菌素+-TEM-1，TEM-2，SHV-1A2c青霉素羧苄西林+-PSE-1，PSE-3，PSE-4A2e头孢菌素+-普通变形菌产生的诱导头孢菌素酶A2f青霉素头孢菌素，碳青霉烯类+-阴沟肠杆菌的NMC-1和IMI-1，粘质沙雷菌的Sme-1A2be青霉素，窄谱和超广谱头孢菌素，单酰胺类+-TEM-3～29，TEM-42，TEM-43，TEM-46，TEM-52，SHV-2～9，PER-1，CTX-M-1，产酸克雷伯菌K1A2br青霉素±-TEM-30～41，TEN-44，TEM-45，TRC-1B3a大部分β-内酰胺类，包括碳青霉烯类-+嗜麦芽假单胞菌的L1，脆弱拟杆菌的CcrA，粘质沙雷氏菌的IMP-1B3b碳青霉烯类-+嗜水气单胞菌的CphA，芳香黄杆菌的PCM-1C1头孢菌素--G-菌产生的ampC酶，MIR-1，MOX-1，CMY-1，BIL-1，LAT-1D2d青霉素，氯唑青霉素±-OXA-1～21，PSE-2ND4青霉素-?洋葱假单胞菌的青霉素酶3超广谱β-内酰胺酶的种类和特性超广谱β-内酰胺酶(ESBL)是以能灭活窄谱和广谱头孢菌素、单环类抗生素及抗G-杆菌青霉素等抗生素为特征的β-酰胺酶，属于Ambler分类的A类，按Bush分类属2be群。大多数的ESBL都是TEM-1、TEM-2、SHV-1酶的突变体，为质粒介导酶，所含耐药基因的质粒可在细菌菌株间转移和传播，有较广的水解底物谱，部分产ESBL菌株不但对β-内酰胺类耐药，有的还可对氨基糖苷类、磺胺、四环素、氯霉素和喹诺酮类耐药。但是，ESBLs不能水解碳青霉烯类和头霉素类抗生素。ESBL一般可被克拉维酸、青霉烷砜和他唑巴坦等酶抑制剂所抑制，其中他唑巴坦的酶抑制作用最强。根据NCCLS1997标准，一旦认定为ESBL突变株，即使药敏结果显示为敏感者，临床上也应视为对所有青毒素类、头孢菌素类及单环类抗生素耐药。ESBL的捡测：(1)E-test法一般认为头孢他丁是识别ESBL的最佳底物之一。单一头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸的MIC之比大于4。(2)双纸片法含头孢他啶纸片的抑菌圈被邻近含阿莫西林/克拉维酸(20/10μg)所扩大。自1983年在欧洲首次发现ESBL以来，目前发现的TEM类ESBL已有50多种，SHV类ESBL12种。肺炎克雷伯氏菌是ESBL的主要携带菌，其次是大肠埃希氏菌。一项研究表明肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌中产ESBL菌的检出率分别为27.3%和5.7%。另一次研究显示：肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌和阴沟肠杆菌中产生ESBL菌的检出率分别为37.4%、30.21%和41.82%。77株产ESBL菌对12种抗菌药物的药敏情况见表2。表277株产ESBL菌对12种抗菌药物的敏感情况抗生素MIC50MIC90耐药菌耐药率株数(%)环丙沙星1163140.26庆大霉素＞16＞165368.83阿米卡星16＞642735.06氨苄西林+舒巴坦32/16＞32/166787.01替卡西林+克拉维酸＞128＞1287192.21哌拉西林128＞12877100头孢唑啉＞32＞326989.61头孢呋肟＞32＞326888.31头孢哌酮＞64＞646077.92头孢他啶＞32＞324963.64头孢曲松＞64＞646381.82亚胺培南0.5400国外文献报道除上述三种细菌外，其他肠杆菌科细菌如粘质沙雷菌、肠杆菌属、构橼酸菌、沙门氏菌和摩根菌也可产生ESBL。目前认为可用于治疗产ESBL菌所致感染的药物有碳青霉烯类、头霉素类抗生素。亚胺培南具有超广谱，高效的抗菌活性，除金属β-内酰胺酶外，它几乎对所有的ESBL高度稳定。目前认为亚胺培南/西司他汀是治疗ESBL菌感染的首选药物。头孢美唑对ESBL菌的敏感性达84.66%。4常见的产β-内酰胺酶的菌株4.1金黄色葡萄球菌金葡菌产生以质粒介导的青霉素酶(属2a群)，可有效地水解天然的和半合成的青霉素类抗生素，此酶为胞外酶，通过水解胞外青霉素，降低产酶株和邻近非产酶株胞内药物浓度而耐药。金葡球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中，耐甲氧西林菌株(MRSA和MRSE)的发生率迅速增多。MRSA全身感染的治疗可单独应用万古霉素，或与磷霉素或或福平合用，在骨、关节感染、心内膜炎或脑膜炎等病例中，万古霉素的组织浓度可能较低。4.2肠球菌肠球菌中很少发现产β-内酰胺酶菌株，但已有报道在粪肠球菌中已出现由质粒介导的青霉素酶，产酶株对氨苄西林，阿莫西林及哌拉西林等青霉素类抗生素耐药，但对含酶抑制剂的复合制剂及亚胺培南/西司他丁敏感。4.3大肠埃希氏菌大肠杆菌主要产生质粒介导的β-内酰胺酶，是产生ESBL的主要菌种。4.4肺炎克雷伯杆菌肺炎克雷伯杆菌以产ESBL而著名。自1983年首次在德国发现产SHV-2型ESBL的鼻炎克雷伯菌后，耐药的克雷伯菌在世界各地迅速出现。北京地区克雷伯杆菌的耐药率也逐年增高。此外，肺炎克雷伯菌通常都有染色体介导的呈低水平组成型表达的β-内酰胺酶SHV-1(2b)，对青霉素类抗生素都耐药。最近学者们在少数克雷伯菌分离株中新发现了对酶抑制剂耐药的ampC型头孢菌素酶(1群)。对肺炎克雷伯菌产酶株性质的鉴定很重要，可通过对头孢噻肟和头孢西丁的药敏来区别，同时对两种药耐药为ampC酶，可推测对第三代头孢菌素及酶抑制剂复合制剂耐药，临床上应考虑其他药物如亚胺培南/西司他丁或头孢吡肟。若细菌对头孢噻肟耐药而对头孢西丁敏感则为产ESBL株，可考虑用含酶抑制剂的复合制剂。4.5肠杆菌属、弗氏柠檬酸杆菌、沙雷菌属、普罗威登斯菌属。该类细菌均具有ampC和ampR基因，因而都具有ampC诱导表达及去阻遏表达的头孢菌素酶(1群)。该类野生菌株在无抗生素的情况下，只产生极微量的酶，接触抗生素后可被诱导产生大量的酶，而去除抗生素后产酶水平又恢复至正常。ampC基因自发突变可致稳定的去阻遏表达而产生持续性的高水平酶。ampC不同表达类型是否产生耐药取决于抗生素对酶的稳定性，抗生素在低于MIC浓度下对酶的诱导能力以及ampC的表达方式等三种因素，见表3。表3ampC头孢菌素酶与β-内酰胺抗生素耐药性的关系氨苄西林及窄谱头孢菌素超广谱(亚胺培南/西司他丁)替莫西林第四代头孢菌素头孢菌素/头孢西丁对ampC头孢菌素酶的不稳定不稳定稳定/视菌种而定稳定稳定性相对高于第三代头孢菌素稳定性低于MIC浓度下的诱导强无(弱诱导剂)强/强弱能力可诱导株耐药敏感敏感/视菌种而定敏感敏感去阻遏株耐药耐药敏感/视菌种而定敏感有一定敏感性对于该类细菌，尤其是测出产诱导酶的菌株，即使药敏结果为敏感，除泌尿系统以外的感染应一定程度地限制超广谱头孢菌素的应用。一旦证实为去阻遏株，除碳青霉烯以外的大多数β-内酰胺类抗生素及酶抑制剂复合制剂都无效。对诱导株及去阻遏株可选用亚胺培南/西司地丁、喹诺酮类及氨基糖苷类抗生素治疗。4.6铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌的耐药机制主要是β-内酰胺酶介导耐药。铜绿假单胞菌具有可诱导ampC头孢菌素酶，所以哌拉西林和第三代头孢菌素在治疗由铜绿假单胞菌所致的感染中存在着危险性。亚胺培南/西司他丁无论对诱导或去阻遏表达的铜绿假单胞菌还是有抗菌活性。铜绿假单胞菌还产生质粒介导酶，主要以PSE-1和PSE-4多见。最近，一些超广谱酶如PER-1，OXA-10，OXA-11在临床上出现，PER-1可被克拉维酸抑制，后二种酶则不被抑制。需特别注意的是在铜绿假单胞菌中还发现了由可传递性质粒介导的碳青霉烯酶，可引起该菌对亚胺培南/西司他丁、美洛培南和除氨曲南以外的其他β-内酰胺类抗生素耐药。5克服细菌β-内酰胺酶介导耐药性的措施克服细菌β-内酰胺酶介导耐药性可采取以下措施(1)开发相对或绝对能抵抗β-内酰胺酶水解作用的新型抗菌药品；(2)应用含酶抑制剂的复合制剂，其中以β-内酰胺类抗生素与酶抑制剂的复合制剂用于克服β-内酰胺酶所致耐药性的前景最为广阔。酶抑制剂的主要作用是抑制细菌所产生的β-内酰胺酶，使抗生素不被水解，同时其对某些病原菌还具有一定程度的抗菌活性。联用酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素