环境生物学-03-污染物的生物效应检测

第三章污染物的生物效应检测2020/4/13提纲第一节生物测试及方法第二节一般毒性试验第三节生物的分子和细胞水平检测第四节生物致突变、致畸和致癌效应检测第五节微宇宙法第一节生物测试及方法生物测试的定义生物测试的方式生物测试的标准化1.1生物测试的定义生物测试（Bioassay）系统地利用生物的反应测定一种或多种环境污染物或环境因素单独或联合存在时，所导致的影响或危害注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。注释2：生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。短期生物测试（ShortTermBioassays）主要用于测定LC50、IC50、EC50，用来快速估计污染物的毒性，评定几种不同毒物或废物对某种生物的相对毒性或评定不同生物对不同条件如温度、pH的相对敏感性等。多数采用静止式。中期生物测试（IntermediateTermBioassays）时间为8d到90d，多数情况下为流动式。长期生物测试（LongTermBioassays）包括全部生活史的生物测试（CompleteLife－cycleBioassays）和部分生活史的生物测试（PartialLife－cycleBioassays）目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物最大浓度或最大允许毒物浓度（MATC）只能采用流动式，要保证试验的环境条件和自然界的季节变化相符合。1.2生物测试的方式1.2生物测试的方式测试气体（液体）的给予方式静止式生物测试流动式生物测试（重复循环式、更新式）被测试生物的种类单物种多物种模拟生态系统生物测试1.2生物测试的方式受试生物选择对试验毒物具有敏感性有广泛地理分布和足够的数量是生态系统重要组成，有重大生态学价值实验室内易于培养和繁殖已有较丰富的生物学背景资料对试验毒物的反应能够被测定具有重要的经济价值、旅游价值，考虑与人类食物链的关系个体大小、生活史长短、曾经受污染情况1.3生物测试的标准化影响生物测试结果的主要因素受试生物：受试生物的年龄、生活阶段、尺寸大小、季节、食物等都会影响生物对毒物的敏感性试验条件：温度、水体pH、试验装置、材料实验室：人员操作水平、数据统计分析标准化1.3生物测试的标准化测试方法标准化的优点增加数据精确度测试可被其他实验室重复各种人员容易进行该测试方便进行数据比较可为环境管理、环境立法提供可靠数据缺点仅能回答普遍性关注的某些问题，对非常见的污染物、易分解污染物和混合污染物等，目前还难于进行。第二节一般毒性试验生物毒性的基本概念急性毒性试验亚慢性和慢性毒性试验蓄积毒性试验2.1生物毒性的基本概念毒物：毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达到中毒剂量时才是毒物。中毒：机体受毒物作用而表现出的疾病状态。中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒。毒性：毒物引起机体易感部位产生有害作用的能力。效应（Effect）也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产生的生物学改变。效应是对个体而言的，这种改变可用一定的计量单位表示。反应（Response）指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定强度的个体在群体中所占的比例。反应是对群体而言的，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡率等。剂量－效应关系和剂量－反应关系以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表示反应的百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到的曲线，即为剂量－效应关系和剂量－反应关系曲线。不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与效应或反应的相关关系不同，可呈现不同类型的曲线剂量－效应关系和剂量－反应关系曲线图剂量10050反应强度（％）剂量－反应曲线（直线型）剂量10050死亡率（％）剂量－反应曲线（抛物线型）对数剂量10050死亡率（％）剂量－反应曲线（S形线型）死亡率（概率单位）对数剂量10050剂量－反应曲线表示毒性的常用参数致死剂量（LD）或致死浓度（LC）绝对致死剂量（浓度）LD100（LC100）:引起被测试生物全部死亡的最低剂量（浓度）半致死剂量（浓度）LD50（LC50）:引起被测试生物50%全部死亡的剂量（浓度）最小致死剂量（浓度）MLD（MLC）:仅引起被测试生物个别死亡的最高剂量（浓度）最大耐受致死剂量（浓度）LD0（LC0）:不能引起被测试生物发生死亡的最高剂量（浓度），但发生了其它中毒症状表示毒性的常用参数最大无作用剂量:用于制定最高容许浓度和最高人体每日摄入量最小有作用剂量（MEL）:中毒阈剂量毒作用带急性毒作用带=（LD50/急性MEL），值越大，引起死亡的危险性越小。慢性毒作用带=（急性MEL/慢性MEL），值越大，引起慢性毒性中毒的可能性越大。半数效应浓度（EC50）半数抑制浓度（IC50）2.2急性毒性试验哺乳动物急性毒性试验1.资料检索类似试验的LD50（LC50）2.根据文献设计试验，得到LD100（LC100）和LD0（LC0）3.继续缩小范围试验，得到LD50（LC50）2.2急性毒性试验哺乳动物急性毒性试验——微囊藻对小白鼠的LD50=50~500mg/kg2.2急性毒性试验水生生物急性毒性试验鱼类毒性试验藻类急性毒性试验水蚤类急性毒性试验2.3亚慢性和慢性毒性试验亚慢性毒性试验——在动物生命周期1/30-1/20的时间内所进行的毒性试验1.实验动物：与急性和慢性试验中的动物品系相同，健康，年幼2.染毒剂量：最高剂量不引起大量致死；最低剂量无任何中毒反应中间剂量介于上述二者之间；设置对照组3.染毒途径：模拟人类在环境中的染毒方式4.观察与评价：初步评估靶器官、最大无作用浓度等2.3亚慢性和慢性毒性试验慢性毒性试验哺乳动物的慢性毒性试验1.实验动物：与亚慢性试验中的动物品系相同，但年龄更小2.染毒剂量：在LD50的1/100~1/20中取3-4个剂量3.染毒途径：模拟人类在环境中的染毒方式4.观察与评价：最终确定最大无作用浓度2.4蓄积毒性试验蓄积毒性作用：低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次与机体持续接触，经一定时间后使机体出现明显中毒的表现物质蓄积：污染物进入机体的量大于排出的量，量的积累功能蓄积：污染物反复作用于机体，最终致病，效的积累2.4蓄积毒性试验试验方法蓄积系数法蓄积系数固定剂量每天连续染毒法剂量定期递增染毒法)1(50)(50ECECKn2.4蓄积毒性试验试验方法20天蓄积试验法每天染毒剂量停止染毒7天后的症状与判断1/20LD50出现死亡，且其它组有剂量—效应关系强蓄积1/10LD501/5LD501/2LD50无死亡，且其它组无剂量—效应关系无明显蓄积作用02.4蓄积毒性试验试验方法受试生物半减期测定法方法：机体接触受试物后，在一定间隔时间内分别测定血液、尿液或器官组织中该物质的量。21122/1lglg2lg)(yyttT第三节生物的分子和细胞水平检测生物致死前，其行为、生理、生化已发生反应。因此，可选择分子和细胞水平的指标测定污染物对生物的影响。常进行的检测：加合物测定、一般代谢酶的活性测定、解毒系统酶类诱导作用的检测、抗氧化防御系统检测这些指标都具有测定周期短、灵敏度高的特点，故可以对污染物的环境影响进行更为准确有效的预报。3.1加合物的测定DNA加合物外界物质进入生物体后，经过生物体内酶的作用，转化形成亲电活性中间产物，该产物与DNA链上特异位点结合形成共价化合物，即称DNA加合物。最早关于DNA加合物的研究是Brooks和Lawley于1964年在《Nature》上关于多环芳烃与DNA形成加合物的报道。DNA加合物在生物体内含量的多少一定程度上反映了化学物质对遗传物质DNA的损伤程度，主要表现在以下几个方面：(1)DNA加合物可以直接造成DNA单链断裂、双链断裂或交联；(2)可以影响DNA的复制过程。3.1加合物测定DNA加合物测定要在大量的正常碱基中检测到含量极低的异常碱基比较困难。伴随分子生物学的发展和仪器分析高新技术的应用，高灵敏度的加合物检测方法越来越多。主要测定方法：色谱/质谱法免疫法荧光法32P—后标记法3.1加合物测定免疫法基本原理是抗原与抗体的反应，用抗DNA加合物的抗体（单克隆或多克隆抗体）来检测靶组织中相应的加合物。免疫法最早用来检测DNA加合物是在1988年，Santella等用自己创建的酶联免疫吸附法(ELISA)检测了铸造工人外周血白细胞中苯并(a)芘的终代谢产物二氢二醇环氧苯并(a)芘与DNA形成的加合物。用免疫法检测DNA加合物的方法有竞争性放射免疫测定(RIA)、固相竞争或非竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)、超敏酶促放射免疫测定(USERIA)等。其检测限一般为1个加合物／107-8核苷酸，目前已有几十种单克隆抗体可供使用。3.1加合物测定荧光测定法方法以多环芳烃(PAH)为代表的一些具有较强共轭电子结构的化学物所形成的DNA加合物，在光照后可发射荧光，利用这一特性使用荧光法可对DNA加合物定量。荧光法主要包括同步荧光色谱法、激发-发射荧光法、低温激光法、荧光标记法等。其中，Vahakangas等人（1985年）发展出的同步荧光色谱法（SFS）应用最为普遍，这种方法的灵敏度为3-10个加合物/108核苷酸。优缺点荧光法的优点是检测时不需破坏DNA链，且可确定加合物不同的立体异构体及DNA链上不同位点的加合物，还可以研究DNA加合物形成和切除与时间之间的动态关系。然而这种方法所需DNA样品量较大（100～1000μg），并且使用面窄（许多DNA加合物无荧光性），所以常与其他方法联用。3.1加合物测定32P—后标记法32P后标记法是目前应用最广泛的方法，它由Randerath和Gupta等在1981年首先建立。其基本步骤是：①将含有加合物的完整DNA降解为脱氧3‘-单核苷酸；②消除正常核苷酸，富集被加合的核苷酸；③在T4多聚核苷酸激酶的作用下，将32P标记到被单核苷酸的5’羟基端，使之形成3‘,5’-二磷酸核苷；④多向薄层层析(TLC)分离出32P标记的加合物；⑤通过放射自显影测定加合物的含量。从标准法建立以后，为了提高灵敏度，又针对第二步陆续发展出一系列新的富集方法，如限量ATP法、丁醇富集法、核酸酶P1/S1富集法、HPLC富集法、二核苷酸/5＇-单磷酸法。这些方法中以丁醇富集法和核酸酶P1富集法最为常用，它们的区别在于，在第二步中，丁醇富集法采用正丁醇提取加合的核苷酸，而核酶P1富集法则用核酸酶P1将正常的3’-单核苷酸去磷酸化，使之不受T4激酶催化，从而仅让加合的核苷酸获得标记。两种方法的灵敏度都可以达到1个加合物/109-10核苷酸，样品用量则只需要1～10μg。DNA加合物常用检测方法比较━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━方法灵敏度(加合物/108核苷酸)每次分析所需DNA量(μg)─────────────────────────────────────────荧光法同步荧光法3～1050～1000低温激光法10～100100激发－发射荧光法10～100100色谱－质谱法色谱－质谱法0.1～150～2000加速器质谱法0.0001～0.0010.001～0.01免疫法免疫法10～10025～60放射免疫法1～1050～5000竞争性酶联免疫法1050非竞争性酶联免疫法10～1000.1～1超敏酶促放射免疫法0.5～125～5032P后标记法32P后标记法0.1～0.011～10━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━（据常平，1995、姚群峰等，2000整理）3.1加合物测定3.1加合物测定蛋白质加合物测定各种蛋白质也可作为大分子形成化学物质加合