蛋白质工程及应用

第三章蛋白质工程及其在食品工业中的应用概述蛋白质是对生命至关重要的一类生物大分子物质，各种生命功能、生命现象、生命活动都和蛋白质有关。在生命有机体催化、运动、结构、识别和调节等许多方面，起着关键的作用。酶.几乎全都是蛋白质。肌肉收缩、精子移动、细胞分裂过程中的染色体移动.高等生物的有序生长和分化过程。抗体蛋白能识别和结合特异性的外源物质，使人体具备抵抗各种细菌、真菌和病毒的能力。由神经细胞膜蛋白构成的离子通道，负责神经冲动的形成和传导。血红蛋白具有结合和释放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和氢离子的携带者。另外，人体的毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血纤蛋白单体聚合而成的。蛋白质的生物学功能1.催化功能：酶2.调节功能：激素3.结构功能：皮、毛、骨、牙、细胞骨架4.运输功能：血红蛋白5.免疫功能：免疫球蛋白6.运动功能：鞭毛、肌肉蛋白7.储藏功能：酪蛋白8.生物膜功能：及神经传导等蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。蛋白质工程就是以蛋白质的结构与功能为基础，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程的概念1983年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念。蛋白质工程的实践依据DNA指导合成蛋白质，因此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构变得符合人们的要求。具体地说，蛋白质工程就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，借以改善蛋白质的物理和化学性质（热稳定性、酶的专一性），或利用化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新的蛋白质。并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系。蛋白质工程的概念蛋白质工程蛋白质工程就是运用蛋白质结构功能和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质三个步骤：1、获得目的蛋白质晶体，并利用X射线技术通过晶体衍射仪收集衍射数据，然后对晶体进行测量、分析，确定蛋白质的空间结构。2、借助计算机对蛋白质进行饰变，通过建立数据库和人工智能等途径确定蛋白质结构和功能的关系确定需要修饰的位点。蛋白质工程的目标和研究过程目标：根据人们的需要改造天然蛋白质或设计创造自然界原来没有的全新蛋白质三个步骤：3、运用定点突变技术等一系列基因操作技术手段来改变编码蛋白质的基因，从而实现对蛋白质的改变。对已经存在的蛋白质“下手”，从结构测定入手。创造全新的蛋白质，要根据已有的蛋白质结构和功能的信息资料进行分子设计------基因表达-------对表达产物的结构和功能进行检测、分析。必经之路：（饰变、分析、检测、修改）*N蛋白质工程的目标和研究过程蛋白质工程是在深入理解目标蛋白质的“结构-功能”关系的基础上，进行严格的分子设计，定向改造一个预期的新特性的蛋白质。一般的两种情况：对天然的蛋白质进行改造。（已有的蛋白质）完全重建一个自然界原来没有的蛋白质。（全新的）对天然的蛋白质操作有：少数几个AA残疾进行替换（小改）分子剪裁（中改）局部重建（大改）重建一个自然界原来没有的蛋白质：从头设计一个全新的蛋白质目前，蛋白质工程主要进行的是中改、小改。“大改”和“从头设计”，要求必须全面掌握蛋白质一级结构决定高级结构的规律，掌握高级结构与功能的相关性。现存的蛋白质数据库还满足不了对蛋白质空间结构的研究实例1：玉米中赖氨酸的含量比较低如果对赖氨酸合成过程中的两个关键酶进行改造,可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。原因：赖氨酸合成过程中两个关键酶——天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响。当赖氨酸浓度达到一定量时，就会抑制这两种酶的活性。人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大的科学命题。2001年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织／器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北京，目前有16个国家和地区的80多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。思考：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。二、蛋白质工程的基本原理1、蛋白质工程的目标根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。2、天然蛋白质的合成过程DNA（基因）转录mRNA翻译蛋白质基因→表达（转录和翻译）→形成氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能中心法则（centraldogma）•生物的遗传信息从DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译和表达。1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA中心法则：遗传信息由DNAmRNA蛋白质的流动途径。补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指导PRO的合成。B：RNA能以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。复制：是亲代双链DNA按碱基配对原则，准确形成两个相同核苷酸序列的子代DNA分子的过程。两条DNA链都可作为复制的模板。转录：是以一条DNA链为模板，将DNA链上储存的遗传信息按碱基配对原则准确转换成互补的mRNA的过程。翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸序列的过程。中心法则：遗传信息由DNAmRNA蛋白质的流动途径。３、蛋白质工程的基本途径预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是：…—丙氨酸—色氨酸—赖氨酸—甲硫氨酸—苯丙氨酸—…（1）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。首先应该根据三联密码子推出mRNA序列，每种氨基酸都有对应的三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出16种。密码子：UCAUGAUUAmRNA密码子密码子密码子mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻碱基密码子总数：43=64种(其中61种密码子是对应氨基酸和起始；另有3个不对应氨基酸，只对应终止)1种密码子只对应1种氨基酸；1种氨基酸可以对应多种密码子。密码子在生物界基本是通用的。这也是生物彼此间存在亲缘关系的证据之一。GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）mRNA序列脱氧核苷酸序列GCT(或C或A或G)TGGAAA(或G)ATGTTT(或C)CGA(或G或T或C)ACCTTT（或C)TACAAA(或G)（2）确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。4、蛋白质工程与基因工程的关系蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品是该基因编码的天然存在的蛋白质。蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对它所编码的蛋白质进行改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的、具有了人类所需要的优点的蛋白质。5蛋白质工程与酶工程的关系•绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？•酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的结构密不可分。决定蛋白质这种特殊生物功能的关键因素是它的分子构象。蛋白质的结构基本组成单位--氨基酸组成生物体蛋白质的20种氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸丙氨酸精氨酸天冬酰氨天冬氨酸半胱氨酸谷氨酰胺谷氨酸甘氨酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸组成生物体蛋白质的20种氨基酸氨基酸英文氨基酸英文赖组脯苏丝色天冬精LysHisProThrSerTryAspArgLysineHistidineProlineThreonineSerineTryptophanAsparticacidArginine谷缬半胱丙亮酪甲硫(蛋)GluValCysAlaLeuTyrMetGlutamicacidValineCysteineAlanineLeucineTyrosineMethionine甘苯丙GlyPheGlycinePhenylalanine谷酰天冬酰异亮GlnAsnIleGlutamineAsparagineIsoleucine肽（肽键与肽)肽键就是由氨基酸的α-羧基与相邻的氨基酸的α-氨基脱水缩合而形成的化学键肽（肽键与肽)肽:氨基酸通过肽键连结起来的化合物二肽:两个氨基酸形成的肽三肽:三个氨基酸形成的肽多肽:许多氨基酸形成的肽蛋白质:大多为100个以上氨基酸组成的多肽氨基酸残基:多肽链中不完全的氨基酸。氨基酸由于形成肽键而失去了一分子水，因此表现出其分子的不完整。氨基末端：多肽链中含有自由α-氨基的一端。简称N-端羧基末端：多肽链中含有自由α-羧基的一端。简称C-端蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构是指氨基酸按一定的顺序通过肽键相连而成的多肽链，也是蛋白质最基本的结构。每一种蛋白质分子都有自己特有的氨基酸的组成和排列顺序即一级结构，由这种氨基酸排列顺序决定它的特定的空间结构，也就是蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构。蛋白质分子的一级结构A链Gly.Tle.Val.Glu.Gln.Cys.Cys.Aln.Ser.Val.Cys.Ser.Leu.Tyr