动物细胞融合

1957年，日本科学家岗田善雄在培养动物细胞时加入失去活性的仙台病毒，发现了细胞融合、产生具有两个核的细胞。后来人们用此方法又成功地诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活，动物细胞融合技术随之诞生。现在这项技术已经广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学科的研究工作中。细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒概念：通过诱导两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）。如果2个不同的细胞进行融合，则称为细胞杂交（cellhybridization）融合细胞的类型：同核体（homokaryon）：由同一生物个体的细胞（基因型相同）所融合形成的融合细胞。异核体（heterokaryon）：来自不同基因型的细胞所融合形成的杂交细胞。1.生物方法（病毒）病毒是最早采用的融合剂。某些病毒被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等。用作融合剂的病毒必须事先灭活（紫外线或β-丙内酯），使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。第二节诱导细胞融合的方法用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图仙台病毒是最常用的病毒诱导融合剂。优点：融合率较高、应用广（对各种动物细胞都适宜）、容易培养（可在鸡胚中大量繁殖）。病毒介导融合的缺点：不稳定，在保存过程中融合活性会降低；制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。2.化学诱导融合化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。PEG可以促使细胞凝结、破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。影响PEG诱导融合效果的因素：1.分子量与浓度：分子大、浓度高的PEG，有利于融合，但毒性也随之增大。一般用分子量PEG1000-4000，40%-60%2.PH:8.0-8.23.诱导时间：长，效率高，但毒性增大、容易形成多核细胞4.温度：38-40度3.物理方法(离心，震动，电融合)最常用的是电融合法细胞在电场中排列成串、聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，促使细胞在相互接触的细胞膜处产生穿孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。细胞电融合技术有许多优点，如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，如：1)亲本细胞2)同核体：同源细胞的融合体3)异核体：非同源的细胞的融合体4)多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体筛选的目的是为了获得优良的杂种细胞第三节杂种细胞的筛选融合细胞的筛选方法1.利用细胞形态、大小、颜色差异筛选2.利用抗药性筛选亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长3.利用营养互补筛选：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。4.利用基因缺陷互补筛选最常用的是在亲本细胞的嘧啶和嘌呤代谢途径中引入缺陷突变来筛选杂交细胞，即HAT筛选系统。细胞合成核苷酸有2条途径：从头合成途径和补救途径。阻断从头合成核苷酸途径的物质：次黄嘌呤(hypoxantin，H)、氨基蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin，T)。HAT培养基：含有H、A、T的培养基在HAT培养基上，细胞从头合成核苷酸途径被阻断，只能利用补救合成途径。在补救途径中，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（简称HGPRT）和胸苷酸激酶（TK）起重要作用。HGPRT-和TK-的细胞不能增殖，但HGPRT--TK+与HGPRT+-TK-融合细胞则可以增殖。鼠人XTK-HGPRT+TK+HGPRT-鼠人鼠人鼠人TK+和HGPRT+HATHATHAT不分裂不分裂分裂HAT筛选示意图第四节融合细胞的克隆化培养筛选出来的融合细胞仍属于异质性的细胞群，不完全是纯系，需要进一步纯化、获得同质性的细胞群。常用方法是克隆化培养。克隆化培养：培养单个杂交细胞、以得到遗传特征相同而稳定的杂种细胞系。1.半固体培养法=平板培养单细胞在软琼脂（或者琼脂糖）培养基上增殖后不能移动，形成集落。待细胞集落长到肉眼可见后，用吸管从琼脂上挑出来(一般8-10天后)，再移到液体培养基中，进行繁殖。2.有限稀释法将细胞稀释到100个/ml，理论上每0.01ml(10μl)含有1个细胞。取0.01ml细胞液在培养板(如96孔板)的小孔中培养，则可获得单个细胞形成的集落。1)取1.0ml5×104/ml细胞+4ml培养基稀释，得1×104/ml.2)取0.5ml1×104/ml细胞液+4.5ml培养基稀释，得1×103/ml.3)取0.5ml1×103/ml细胞液+4.5ml培养基稀释，得100cells/ml.4)取0.01ml的100cells/ml细胞液于培养板小孔，加0.1ml培养基，培养后得杂种细胞系。3.显微镜操作法通过显微操作分离杂交单细胞、分别单独培养。4.盖片分离法1)用钉锤于洁净的橡胶上砸干净盖玻片；2)选择碎块、大小形态适用碎片；3)加培养液、进行细胞培养；4)倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片；5)进行单个细胞培养。5.荧光激活分离法用一种荧光激活细胞分类器（FluorescenceActivatedCellSorter，FACS）分离杂交细胞。原理：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在激发光的激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。第五节细胞融合技术的应用动物体受抗原刺激后可产生抗体，抑制抗原的作用；增加身体的抗体就可以提高机体的抗病能力。抗体具有特异性，其特异性取决于抗原分子的决定簇。抗原决定簇：存在于抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，一般由5～8个氨基酸或单糖或核苷酸残基组成。一、B淋巴细胞杂交瘤生产单克隆抗体各种抗原分子具有很多抗原决定簇，不同抗原的决定簇数目不同，如白喉类毒素有8个，流感病毒有40多个。抗原决定簇大多存在于抗原的表面，但也有隐藏在抗原内部。抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中只产生一种抗体。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞，因此，当机体受抗原刺激时，每种B淋巴细胞产生一种抗体（单一抗体），整个动物可以产生众多不同的抗体（多克隆抗体）。用免疫动物生产、制备抗体效率低，且多克隆抗体应用有很多缺陷，分离这些不同的抗体极为困难。选出一个合成一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经增殖而形成的细胞群，即单克隆细胞。单克隆细胞合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体具有理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合特异性强、质量可控等优点，用途：1．医学诊断试剂广泛应用于酶联免疫、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。单克隆抗体促进了商品化试剂盒的发展，试剂盒灵敏度高、使用方便、快速，用于病原微生物抗原、肿瘤抗原、免疫细胞及其亚群的检测，激素、细胞因子的测定。2.食品安全的检测食品中的毒素（如黄曲霉毒素）、有机农药的检测。方便、灵敏3．蛋白质的提纯单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。4．肿瘤的导向治疗（生物导弹）化疗、放疗：无选择性，副作用大把肿瘤单克隆抗体与抗癌药物结合起来，就成为“生物导弹”。把这种抗体“导弹”注射到癌症患者的血液中，它就会在患者体内追踪并附着于癌细胞上，然后与抗体结合的抗癌药物杀伤和破坏癌细胞，而且很少损伤正常组织细胞。这种抗体“导弹”具有高度选择性，对癌细胞命中率高、杀伤力强大、副作用小等优点。动物细胞融合技术为单克隆抗体的制备提供了个全新、高效的方法。1975年，G.Kohler（德国）和C.Milstein（阿根廷、英国双国籍）把产生抗体的Ｂ淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，证明了这种细胞既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又有Ｂ淋巴细胞产生抗体的功能。因此，这种杂交瘤细胞就能产生大量单一类型的高纯度抗体，单克隆抗体。GeorgesJ.F.KöhlerCésarMilsteinNielsK.Jerne1984年，G.Kohler、C.Milstein和NielsK.Jerne获得Nobel奖，表彰他们关于免疫控制机制理论的研究以及开发制备单克隆抗体技术。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology）。动物细胞融合技术为生产单克隆抗体过程（1）免疫小鼠、制备B淋巴细胞取6-8周龄Balb/C雌鼠，基础免疫2周后，再静脉加强免疫一次，3-5天后分离、制备B淋巴细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞。（2）制备骨髓瘤细胞收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)。（3）细胞融合(1)按1：5-10混合B淋巴细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。(2)将1ml40％的PEG液一滴滴加入细胞混合物中，在60秒内加完，同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管；(3)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(4)于5分钟内慢慢加入20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，HAT选择：淋巴细胞及其融合细胞：不能生长，5~7天死亡；骨髓瘤细胞及其融合细胞：DNA从头合成途径被阻断；HGPRT缺乏，DNA合成的补救途径受阻，不能生长，5~7天死亡；淋巴细胞和骨髓瘤融合细胞：能生长(5)离心(800转/分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(6)取96孔板，每孔加50l，再加取等体积细胞悬液。(7)在CO2培养箱中37℃培养；24h后更换成HAT选择性培养液（4）杂交瘤细胞的选择和克隆化培养第一次抗体筛选：融合培养24h后更换成HAT选择性培养液，杂交瘤细胞生长增殖、形成细胞群，再利用免疫学方法检测其抗体合成。第二次抗体特异性筛选：从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。由于杂交瘤细胞的染色体不稳定，需要进行3-5次克隆化培养，才可得到基因型稳定、特异性抗体合成稳定的杂交瘤细胞。（5）克隆化培养二、T淋巴细胞杂交瘤生产干扰素、细胞因子T淋巴细胞在免疫系统中占有极重要的位置，在体内能产生多种淋巴因子，如白介素2、巨噬细胞激活因子、B细胞生长因子、抗原特异性或非特异性抑制因子等。将胸腺瘤细胞与T细胞融合的细胞，称为“T淋巴细胞杂交瘤”。利用T淋巴细胞杂交瘤可以获得大量这些因子，从而可用于治疗缺乏这些淋巴因子的免疫缺陷患者或改善某些超敏反应状态。三、制作抗肿瘤细胞疫苗哺乳动物、人的树突状细胞（dendritecell,DC）专一向淋巴细胞提供特异性抗原，启动机体T细胞免疫。DC与无