PCR技术及其应用

第八章PCR技术及其应用前言PCR技术简史第一节PCR技术原理和工作方式第二节PCR产物的克隆第三节PCR扩增未知DNA片段第四节与反转录相关的PCR第五节PCR产生DNA指纹第六节实时定量PCR本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！一、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。第一节PCR技术原理和工作方式DenaturetemplateDNAbyheat(95oC)TargetSequenceTargetSequence①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step1–PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。Endofthe1stPCRCycle–Resultsintwocopiesoftargetsequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程71缓冲液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可能有添加剂、共溶剂等。厂商一般以10倍的贮存液形式提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。厂商一般以25mmolMgCl2+形式提供，使用浓度为0.5mmol/L至2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTPs、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。二、PCR反应体系2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程82、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。厂商一般提供为10mmol/L或4mmol/L的贮存液，使用浓度为0.2mmol/L左右。dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。dNTPs可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程9PCR引物的设计一般原则1.引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。2.解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，较高时特异性增加，但退火效率下降，过低时退火效率较高，但特异性下降。两条引物间的Tm值越接近越好。计算Tm值的方法很多，简易公式为Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，适于短于20nt的引物。长引物的Tm值计算公式见书，但比实际值往往偏低。精确的Tm计算需要考虑缓冲液的盐离子浓度和引物内部的相邻碱基的动力学参数。3、引物一般溶成10mol/L的贮存液，使用浓度为0.1-0.5mol/L。浓度过低则产量低，过高则易导致错配，PCR特异性下降。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程103.避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。4.要避免两个引物间特别是3’末端碱基序列互补以及同一引物自身3’末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发夹结构。5.G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。6.引物3’末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3’末端为G、C或T时引发效率较高，但3’要避免较密的C+C或G+C连排。7.引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。8.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程114、模板单、双链DNA均可。一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是限制PCR扩增的重要因素。不同属性的模板所加的理想的量不同，哺乳动物基因组总DNA、酵母DNA、细菌DNA、质粒、M13噬菌体作模板时，需要的量分别为1g、10ng、1ng、1pg和1%噬菌斑。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程125、耐热性的DNA聚合酶有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，但在3’→5’外切酶活性(proofreading,校正功能，决定保真度,fidelity)、耐热性和附加功能上有差异。酶量增加使产量增加，但反应特异性下降，酶量过少虽能保证特异性，但影响产量。常用的有：1）TaqDNA聚合酶：最常用，来自嗜热水生菌(Thermusaquaticus)，95℃时的半衰期为40分钟，75℃时活性最强，没有校正功能，错配率为8.9×10-5至1.1×10-4。标准使用浓度一般为2.5U/50l。2）TthDNA聚合酶：来自嗜热热细菌(Thermusthermophilus)HB8，95℃时的半衰期为20分钟，74℃时进行扩增，除在Mg2+催化下进行常规的PCR扩增外，还具有在MnCl2催化下的高温反转录功能。3）VentDNA聚合酶：来自嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)，100℃时的半衰期为1.8小时，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程134）PwoDNA聚合酶：来自嗜热细菌(Pyrococcuswoesei)，100℃时的半衰期大于2小时，有校正功能，保真度高。5）PfuDNA聚合酶：来自激烈热球菌(Pyrococcusfariosus)，具有极高的热稳定性，目前公认是最保真的。6）混合DNA聚合酶：将具有校正功能的酶与Taq酶按一定比例混合，具有类似Taq的强启动合成能力，同时又有一定的保真度，而且具有一定的扩增长片段的能力。Taq酶的延伸速度为1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min来预计。PCR扩增不是绝对真实的，因为具校正功能的DNA聚合酶只是比不具校正功能的DNA聚合酶相对保真而已，错配率相差在两个数量级以内。一些具校正功能的酶作PCR时，即使产物短也可能得不到产物，原因不明，估计可能与该酶的外切活性将引物降解有关。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程14三、PCR反应程序1、常规程序：94℃左右预变性几十秒至几分钟；94℃左右变性10秒至1分钟；50-65℃左右退火30秒至1分钟；20-35个循环72℃左右延伸30秒至几分钟；72℃左右最后延伸和加尾3-10分钟；4-25℃保持3分钟或更长。2、退火和延伸温度：退火温度Ta值由Tm值决定，多数情况下Ta采用Tm减去3-5℃，较高时特异性强但退火效率低，较低时退火效率增加而非特异扩增增加，可根据实际研究目的采用高特异性或低特异性退火。当退火温度高到与延伸温度接近时，可以将退火和延伸温度合为一个，这时PCR就由三步法变成了两步法。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程153、反应时间：变性步骤一般为5秒至1分钟，变性温度高时时间短，低时时间长，简单模板时间短，复杂模板时间长，尤其是直接用细胞作模板时预变性和变性时间都要长。退火时间一般为30秒至1分钟即可，引物结构好的时间短，引物结构差的退火时间宜长。延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。Taq扩增时按1kb/min计算，具校正活性的酶则按0.6-0.7kb/min计算。4、循环次数：多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。PCR扩增的后期循环易进入平台期，实际上是由于PCR扩增条件的逐步劣化而引起的。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程165、PCR反应液的配制：加试剂顺序：双蒸水、缓冲液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。加DNA聚合酶前应将其余试剂混匀后再加入酶。加完酶后应先放回酶，然后再混匀PCR成分，覆盖矿物油，并上机。酶要用冰盒取放，禁止因手的接触或暴露于空气中而使酶升温。第一次使用各试剂时要轻柔充分混匀。正确保存各种试剂，尤其是要避免核酸因反复冻融而降解，各试剂宜分装成适量的小管。热启动(hotstart)：购买的DNA聚合酶偶连有特异抗体，只有当温度升至68度或更高时，抗体才会失活并释放出DNA聚合酶，从而增加PCR的特异性，减少低温下尤其是配制PCR体系过程中由于引物错配而带来的非特异性扩进。但启动的DNA聚合酶的价格较贵。早期有蜡珠法。冷启动(coolstart)：在冰水浴上配制PCR成分，然后立即放到已运行并暂停于预变性之初的PCR仪的block上面，直接进入高温变性和随后的PCR扩增。延迟成分法：扣留一种PCR关键成分，直到已进入预变性后才加入。PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，2～4小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR中其它注意的事项1.防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作2.设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板、无模板试剂对照：除模板外的所有组分第二节PCR产物的克隆一、在PCR产物两端添加限制性酶切位点在PCR引物的5’加上根据需要而设计的酶切位点，PCR产物内部没有该切点。在酶切位点的5’加3个左右的保护碱基，基数目多少取决该酶的性质。PCR物产物经电泳后回收后，直接用限制酶进行切割，纯化后与目标载体连接重组。该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明PCR产物的身份正确且没有突变。2020/4/15西南大学生物技术专业基因工程20二、TA克隆这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究。Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活性，通常在其产物DNA分子每条链的3’末端加上一个突出的A。T载体：通过特定制作技术制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体，其每条链的