PCR技术的过程和意义

PCR技术的过程和意义一、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。二、PCR技术的步骤PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：1、模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。三、PCR技术的意义1、特异性强PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。2、灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。3、简便、快速PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。4、对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。四、PCR技术主要应用的领域1、核酸的基础研究：基因组克隆2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序3、反向PCR测定未知DNA区域4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控6、cDNA末端快速扩增技术7、检测基因的表达8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学。五、关于RT-PCR4月17日，在北京检验检疫局承担的国家质检总局科技计划项目“禽流感病毒H7N9亚型双重荧光RT-PCR定型技术研究”鉴定会上，专家组一致认为：该项目创新性地实现了对禽流感病毒H7N9亚型的一步快速定型，可在一次检测中确认样品中是否存在H7N9亚型禽流感病毒或其他H7亚型和N9亚型的禽流感病毒;在通用性、特异性、灵敏性上，技术优势突出。专家组同意项目成果通过鉴定，并建议在进一步扩大和完善动物临床验证实验基础上，尽快推广应用。RT-PCR为反转录RCR（reversetranscriptionPCR）和实时PCR（realtimePCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。利用RT-PCR技术，也许在不久的将来，H7N9的快速诊断将成为一个非常容易的问题。