LightCycler HRM CN

LightCycler480实时定量PCR系统在高分辨率熔解曲线分析(HRM)研究中的应用高分辨率熔解曲线的原理高分辨率熔解曲线研究平台高分辨率熔解曲线的应用高分辨率熔解曲线的实验设计高分辨率熔解曲线的原理高分辨率熔解曲线研究平台高分辨率熔解曲线的应用高分辨率熔解曲线的实验设计基于Real-timePCR的基因位点变化分析当前的主流技术对于已知突变位点的基因分型•使用杂交探针或简单探针法(熔解曲线)•使用水解探针(终点检测)•使用非标记探针结合饱和荧光染料(高分辨率熔解曲线)对于新突变位点的筛选(e.g.,SNPs,缺失,插入)相对于目标基因的特定区域•使用饱和荧光染料对扩增子进行高分辨率熔解曲线分析熔解曲线的分析已有应用与创新应用SYBRGreenI产物特异性基因的高分辨率扫描荧光标记探针的基因分型5’3’5’3’ExcitationSGEmissionSGSGSGSG传统的熔解曲线分析SYBRGreenI熔解曲线分析5’3’5’3’ExcitationEmissionSGSGSGSGSG•SYBRGreenI是具有绿色激发波长的染料，能结合于任意dsDNA双螺旋小沟区域•信号强度与结合染料的DNA分子数成正比•在延伸结束时进行检测传统的熔解曲线分析SYBRGreenI熔解曲线分析传统的熔解曲线分析SYBRGreenI熔解曲线分析•引物二聚体由于Tm值较低，随温度升高，会更快速解链•对熔解曲线求导后可观察到，“速率”曲线的最高峰是分离速率最大的点，即等同于熔解温度，左侧的小峰为引物二聚体导致传统的熔解曲线分析SYBRGreenI熔解曲线分析SYBRGreenI熔解曲线反映片段的大小250bp片段500bp片段500bp片段250bp片段但是……•非饱和态结合允许染料在熔解过程中会发生重新定位•因此，SYBRGreenI对于SNP等单点突变，如纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同，无法进行准确区分•如果单纯增加染料浓度，SYBRGreenI会对PCR反应产生毒性和抑制作用，同样达不到目的•SYBRGreenI无法适用于HRM，需要寻找低浓度，对PCR影响小的染料和方法SYBR®GreenI一些染料在熔解开始后可以重新定位高分辨率熔解曲线定义高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:•它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR仪器与专门的分析算法•分辨率高，可以区分一个碱基突变的多组核酸样本，可以区分野生型（纯合子）、突变型（纯合子），杂合子•使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)•与其它方法相比，具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)•PCR产物的Tm取决于GC含量.•纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线(包括野生型纯合子或突变纯合子).•杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.高Tm低TmG:CA:TG:GG:T=G:AT:T=A:AT:CA:CC:CMeltingCurvesTemperatureCGTA杂合子扩增两种同源双链两种异源双链CATG观察到的4种双链结构基因分型高分辨率熔解分析纯合子野生型(homoduplexes)纯合子突变型(homoduplexes)杂合子高分辨率熔解曲线的原理高分辨率熔解曲线研究平台高分辨率熔解曲线的应用高分辨率熔解曲线的实验设计基因扫描:寻找未知的遗传变异(SNPs,突变,缺失)仪器:高分辨率高均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响试剂:饱和荧光染料，确保获取高分辨率熔解曲线软件:计算熔解曲线并进行基因分型•对有异常熔解曲线的样品进行测序验证GeneXYExon1Exon3Exon2PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型要进行HRM实验，有什么要求?(1)•高精准度的仪器能够识别出全PCR产物中单个突变位点造成的熔解曲线改变–高均一性高分辨率的温控性能–高灵敏度高均一性的光学系统(无边缘效应)要进行HRM实验，有什么要求?(2)创新的饱和荧光染料能够识别单碱基突变,并且不抑制PCR反应不饱和双链DNA荧光染料SYBRGreenI•纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同饱和双链DNA荧光染料ResoLight、LCGreen、EverGreen•都为绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm，发射荧光波长470-520nm。•序列的变化会导致熔解曲线的显著变化纯合子杂合子VSvs创新的HRM染料准确区分野生型纯合子和杂合子LC480HRMMasterMixSYBRGreenIvsLightCycler®480ResoLightDye饱和和非饱和荧光染料的比较dsDNA饱和型荧光染料SYBRGreenI解离后再结合无，因此能准确实时地反应DNA熔解状态的细微改变有，无法准确实时地反映DNA熔解状态的细微改变DNA结合倾向性无DNA大小倾向性倾向于大DNA片段杂合子的区分能区分纯合子与杂合子不能区分纯合子与杂合子对PCR的抑制对PCR无抑制作用对PCR存在一定抑制作用0%20%40%60%80%100%120%050100150200250300350Excitationtime[min]FluorescenceResoLightotherHRMdyeSYBRGreenILightCycler®480ResoLightDye荧光信号稳定性光照下荧光衰减程度比较饱和荧光染料的性能比较ResoLight对于纯合子和杂合子的区分更加容易要进行HRM实验，有什么要求?(3)•分析软件根据熔解曲线的不同自动进行基因分型消除批间差与其它因素造成的差异，适合高通量数据的分析LightCycler480专属HRM分析软件，通过荧光信号归一，温度差减修正，自动识别类别，可快速确认分析样本间的差异并分类LightCycler®480软件1.5版本基因扫描模块-高分辨率熔解曲线分析HRM应用•突变发现/筛查/扫描•SNP基因分型/等位基因区•连锁分析•物种鉴定•表观遗传学/DNA甲基化•微卫星分析32基因扫描的分析流程原始扩增曲线33基因扫描的分析流程归一化34基因扫描的分析流程TemperatureShift35基因扫描的分析流程差减曲线DifferencePlot–选择分析模式Analysis–Comn/Vars36基因扫描的分析流程Analysis–AutoGroupLightCycler®480在HRM领域发表的文献当前发表文献最多的实时定量PCR系统•至2010年12月使用LightCycler480平台发表的文献共213篇，占所有HRM文献总数的60%•应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等•影响因子10分以上7篇，包括Nature,NatureMethods,NatureGenetics，影响因子5－10分14篇，5分以上文章占总数的18％•逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点41127531180204060801001201402007以前2007200820092010高分辨率熔解曲线的原理高分辨率熔解曲线研究平台高分辨率熔解曲线的应用高分辨率熔解曲线的实验设计高分辨率熔解曲线的应用主要应用•基于基因扫描的基因分型•基于非标记探针的基因分型–突变筛查，如发现靶基因扩增产物中是否存在SNP或其它突变PCR产物的高分辨率熔解曲线基于基因扫描的基因分型DNAwithheterocygoteSNPPCR++...TCTTTTTCCCCCGAAAAAAGGGGGDenaturationreannealing+IntercalatingfluorescentdyeIncreasingtemperature基因扫描实例–显著降低测序成本•MBL2基因序列变异分析(384个样本,扩增子长度219bp):4种最常见的基因型在图像上被分为4组;少量样本呈现另外的3种遗传变异变异比例的定量分析•Example:CYP2C9,扩增子长度144bp,SNPC/TportionTallele50%,1:120%,1:514%,1:710%,1:104%,1:250%大鼠中MHC相关的基因分型获得16种不同的基因型非标记探针的高分辨率熔解曲线基于非标记探针的基因分型•PCR产物与探针形成局部的DNA双链，该局部双链在较低温度下解链，如果存在错配，则相比于完全匹配的探针-DNA局部双链结构，其解离温度降低•无任何荧光标记的探针识别已知突变位点•进一步升温则是PCR产物解链LightCycler480突变扫描Target:TNFSF4SNP-1:rs10489266(AG),SNP-2:rs1234315(CT)ForwardprimerSF101:TTCAGGCACAGATTTCTGATAGACTATCTAReverseprimerSF102:GGACTCTGCTTATGTGCCTGAGAUnlabeledprobeSF104:AGACTAGCCCAGTGATGAACTTTGGAATG-P扩增子长度:136bp.SNP-1GSNP-2T野生型序列:...CTAGGCATTCCAAAGTTCATCACTGGGCTAGTCTAGCA...合成非标记探针序列:GTAAGGTTTCAAGTAGTGACCCGATCAGA扩增子熔解过程(使用基因扫描软件，差减显示)单倍型A/CA/C纯合子野生型A/TA/T纯合子突变型A/CA/T单SNPA/TG/T单SNPA/CG/T双SNP无其他突变体熔解曲线求导凸显差异(TmCallingModule)Allele(SNP-1/SNP-2)G/TA/TA/CAnnotation:Allel-1SNP-1/SNP-2Allel-2SNP-1/SNP-2单倍型A/CA/C纯合子野生型A/TA/T纯合子突变型A/CA/T单SNPA/TG/T单SNPA/CG/T双SNP无其他突变体Time(sec)0306090120筛查是否有突变探针进行基因分型非标记探针的高分辨率熔解曲线同时进行基因分型与未知突变筛查51全扩增子区段熔解曲线野生型突变型杂合型探针结合段熔解曲线一阶导数野生型突变型杂合型探针法和熔解曲线法联合应用同时检测已知的SNP+扫描未知突变•发现新的SNP位点•已知SNP的检测分析•单倍型分析•杂合性丧失的筛查•种群中的等位优势分析•分类学物种鉴定•DNA遗传作图(发现携带高度可变座位的个体)•潜在易感基因的鉴别•DNA甲基化分析•RNA编辑…高分辨率熔解曲线的应用潜在应用高分辨率熔解曲线的原理高分辨率熔解曲线研究平台高分辨率熔解曲线的应用高分辨率熔解曲线的实验设计试验设计准则•对目标序列进行充分了解确定目标序列内的各种变化形式检查种属同源性内含子外显子边界剪切位点已知SNP等•将引物的退火温度设计在60度左右，片段长度100-250bp可以使用长片段，但长片段检测的灵敏度会受影响•确定产物和引物在退火温度时的折叠特征(使用如DINAMelt，并确定特异性(BLAST搜索)高分辨率熔解曲线的实验设计PCR程序:扩增－温度漂移Example:TouchdownPCR92基因扫描的实验设计技巧提高野生纯合子和突变纯合子的分辨率(1)•杂合子的扩增熔解曲线(包括野生型单链和突变型单链)形状差异和纯合子差异明显，可以直接从图上观察出来•纯合子的扩增熔解曲线(包括野生型纯合子和突变性纯合子)形状非常相似，通常难以从图上观察出来在未知样本中人为掺入一定量的一种已知的纯合子DNA•参考文献:LiewM,PryorR,PalaisR,MeadowsC,EraliM,LyonE,WittwerC.GenotypingofSingle-NucleotidePolymorphismsbyHigh-ResolutionMeltingofSmallAmplicons.ClinChem.50:7(2004)1156-116493