清除DPPH自由基能力检测方法-实验操作-李熙灿

DPPH自由基清除法李熙灿/XicanLi（广州中医药大学）[文献]XicanLi,JingLin,YaoxiangGao,WeijuangHan,DongfengChen.AntioxidantactivityandmechanismofRhizomaCimicifugae.ChemistryCentralJournal.2012;6(1):140.[原理]DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。NNO2NO2NNO2当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。[实验步骤]1.1DPPH测试液的配制取DPPH1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。1.2样品液的配制样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。1.3预试取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120、160、200μL。1.4测量A0值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL（x是根据1.3预试结果确定样品液的用量），再加（1000-x）μL95乙醇（或无水乙醇），混合，静置30分钟后，测A值（519nm）。如：某样品的用量梯度为40、80、120、160、200μL，则加样表如下：表1加样表样品液95乙醇（或无水乙醇）DPPH测试液总体积40μL960μL2mL3mL80μL920μL2mL3mL1200μL880μL2mL3mL160μL840μL2mL3mL200μL800μL2mL3mL1.5正式测量方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A0.[实验结果]清除率（抑制率）的计算公式：00%=100%AAInhibitionA[实例]厚朴酚magnolol的DPPH清除率曲线：(图中Trolox和BHT为阳性对照组)0.0000.0040.0080.0120.0160.020020406080100ADPPHInhibition%Concentrationmg/mLTroloxBHTMagnolol