法舒地尔对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用

法舒地尔对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用赵新云孔辉王晶晶闫晓培刘汶睿曾晓宁解卫平（南京医科大学第一附属医院呼吸内科南京210029）【摘要】目的：探讨Rho激酶抑制剂法舒地尔（fasudil）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所致小鼠败血症继发急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）的保护作用及机制。方法：C57BL/6小鼠随机分为对照（Control）组、LPS模型组、LPS+fasudil（10mg/kg）组、LPS+地塞米松（dexamethasone，Dex，5mg/kg）组。造模后观察不同时间点各组别生存率，6h处死小鼠收集血清、支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺组织，Elisa测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-10水平，检测BALF中细胞计数和蛋白浓度，HE染色观察各组肺组织病理改变，湿干重比评估肺含水量，Elisa测定肺组织中性粒细胞髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）含量。结果：Fasudil可显著改善动物生存率、延长生存时间；缓解肺组织炎性损伤及肺水肿程度，降低MPO含量，下调血清中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α水平，上调抗炎细胞因子IL-10表达。结论：Fasudil可有效缓解LPS所致的小鼠ALI，其作用可能通过减轻受累肺组织炎症反应相关。【关键词】急性肺损伤，脂多糖，法舒地尔【中图分类号】【文献标识码】AFasudilattenuateslipopolysaccharide-inducedacutelunginjuryinmiceZhaoXingyun,KongHui,WangJingjing,YanXiaopei,LiuWenrui,ZengXiaoning,XieWeiping(DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210029,China)Correspondingauthor:XieWeiping,Email:[e-mail]【Abstract】Object:Toinvestigatetheprotectiveeffectsoffasudil,aRhokinaseinhibitor,ontheinflammationoflipopolysaccharide(LPS)-inducedmiceacutelunginjury(ALI)secondarytosepsisandit’sprobablymechanisminmice.Methods:C57BL/6micewererandomlyassignedtoControlgroup;LPSgroup;LPS+fasudil(10mg/kg)group;LPS+Dexamethasone(Dex,5mg/kg)group.Mortalityratesofdifferenttimepointsofeachgroupwasassessedafterthemodelestablished.Miceweresacrificedat6hafterLPSinjection.Serum,bronchoalveolarlavagefluid基金项目：国家自然科学基金（81273571,81001427）；江苏省人事厅六大人才高峰（2008074）；江苏省科技厅科技支撑计划（BE2011801）；江苏省呼吸病临床医学研究中心（BL2012012）通讯作者(Correspondingauther)：解卫平Email：[e-mail](BALF)andlungtissueswerecollected.ElisawasperformedtoanalyzethelevelofTNF-α、IL-1βandIL-10intheserum,analyzethecellcountingandtheproteincontentinBALF,stainwithhematoxylinandeosin;testthewet-to-dry(W/D)weight;measurethecontentofmyeloperoxidase(MPO)contentinlungtissue.Results:Fasudilsignificantlyimprovedthemortalityratesandprolongedthesurvivaltimeofmice,reliefedofinflammatoryinjuryandedemaoflungtissue,decreasedMPOcontent.Moreover,fasudildownregulatedtheexpressionofTNF-α、IL-1βandupregulatedIL-10inserum.Conclusions:FasudileffectivelyreducedtheLPS-inducedALI,controllingtheinflammatoryresponseinthepulmonarymayplayimportantrolesinthemechanismsinALI.【KeyWords】:acutelunginjury;lipopolysaccharide;fasudil急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）是临床疑难危重症之一，常与微生物感染、损伤等因素有关，临床治疗困难，病死率高。革兰阴性细菌感染所致的败血症是引起ALI发生的最常见原因。其机制可能与肺部炎症渗出、气体交换功能受损有关，各种信号通路参与其中，机制复杂，其确切机制尚不完全明了。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，是感染性疾病的主要病原[1]，可激活大量的炎症细胞，诱导急性炎症，导致ALI发生。Rho激酶是小分子GTP酶Rho家族的效应器之一，参与调控细胞的多种重要功能，如细胞骨架的维持，细胞粘附、增殖和迁移，细胞凋亡及基因转录等。Rho/Rho激酶通过调制NF-κB的活性，调控多种炎症因子的合成释放，抑制组织器官炎症反应，是一种潜在的防治炎症相关性疾病的靶标[2]。Meyer-Schwesinger等[3]研究发现，Rho激酶抑制剂通过抑制NF-κBp65信号通路，保护LPS所致的急性肾损伤小鼠；Shao等[4]研究提示，选择性Rho激酶抑制剂法舒地尔(fasudil)可通过抑制TLR-4、NF-κBp65活化，降低IL-1β、IL-6、TNF-α等水平发挥抗炎效应，减缓自身免疫性脑脊髓炎的进展。Fasudil作为一种被广泛认可的选择性Rho激酶抑制剂，目前已被用于治疗脑血管痉挛[5]、脑卒中[6]和外伤性脊髓损伤[7]。然而，尽管近年来已有研究表明fasudil对ALI有一定治疗作用，但其具体机制尚未完全阐明。本实验以LPS建立小鼠ALI模型，通过检测BALF、血清中各类炎症因子水平探讨fasudil对小鼠ALI保护作用的相关机制。1材料与方法1.1动物和分组健康雄性6-8周龄C57BL/6品系小鼠128只，体重18-22g，购自北京维通利华。实验小鼠均分笼饲养在清洁环境中，保证足够的食物和水，实验室温度维持在25℃左右。1.2材料Fasudil购自天津红日药业股份有限公司，LPS（E.coli055:B5）、地塞米松（dexamethasone，Dex）购自Sigma公司，髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）测定试剂盒购自Hycultbiotech公司，小鼠TNF-α、IL-1β、IL-10ELISA测定试剂盒购于R&D公司。1.3小鼠急性肺损伤模型的构建取小鼠48只，以4%水合氯醛1g/kg腹腔注射麻醉，随机平均分成以下4组，每组12只：Control组（生理盐水0.2ml腹腔注射），LPS组（LPS30mg/kg腹腔注射），fasudil+LPS组（LPS腹腔注射前1h给予fasudil10mg/kg)，Dex+LPS组（LPS腹腔注射前1h给予Dex5mg/kg）。注射LPS或生理盐水后6h麻醉动物，摘眼球取血并处死动物，收集BALF和肺组织，测定各项指标。1.4小鼠生存率评估为观察fasudil对急性肺损伤的保护效果，取小鼠80只，同上分为4组，每组20只，注射LPS或生理盐水后记录各组小鼠的精神状态和生存情况，每8h观察一次，共观察72h，计算生存率并绘制生存曲线。1.5ELISA检测血清TNF-α、IL-1β、IL-10炎症因子水平小鼠摘眼球取血后37℃静置0.5h，3500rpm，4℃离心10min，收集上层血清用以检测各种炎症因子水平。参照试剂盒说明书，分别将标准品和血清样本加入相应孔中（100μl/孔），封板胶纸封住反应孔，37℃温箱孵育90min；洗板5次，除空白孔外均加入生物素化抗体工作液（100μl/孔），37℃温箱孵育60min；洗板5次后加入酶结合物工作液（100μl/孔），37℃避光孵育30min；洗板5次后加入显色底物100μl/孔，37℃避光孵育15min，加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值。1.6BALF炎症细胞总数、分类计数及蛋白含量测定固定小鼠，切开颈部正中皮肤及肌肉，暴露颈部气管。行气管插管，用0.4mL生理盐水灌洗肺组织3次，合并3次收集BALF。3500rpm，4℃离心10min，沉淀以1ml红细胞裂解液重悬沉淀去除红细胞，3500rpm，4℃二次离心10min，100μl生理盐水重悬沉淀行白细胞计数，Wright-Giemsa染色后行细胞分类计数。留取上清用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其中的蛋白含量，比较各组小鼠炎性渗出的严重程度。1.7肺组织病理学观察及评分动物处死后，解剖观察肺大体标本。取小鼠左肺下叶新鲜组织，4%多聚甲醛固定24h，酒精梯度脱水、脱蜡后石蜡包埋，制作厚度为4μm的切片，HE染色后光镜下观察肺组织病理改变。参照Mikawa等[8]方法，肺损伤通过肺组织充血、水肿、间质炎症改变及炎症细胞浸润程度4个范畴进行评判，根据每个范畴的严重程度分为0级（正常）、1级（轻度）、2级（中度）、3级（中度）、4级（极重）4个等级，通过对4个范畴的评分加成计算总的肺损伤评分。1.8肺组织湿/干重量比（W/D）小鼠固定后开胸，取左肺叶用生理盐水冲洗2次，滤纸吸干表面血水后称此叶肺组织的湿重，置70℃恒温箱烘烤72h至干重恒定，称干重后计算湿/干重量比。W/D代表肺组织含水量，用于评定肺水肿的严重程度。1.9肺组织MPO含量测定取约100mg肺组织置于预冷的1mlPBS（pH=7.4）中匀浆，再以12000g，4℃离心10min取上清，参照MPOELISA试剂盒说明书检测肺组织中MPO的含量。1.10统计学分析使用SPSS13.0软件进行统计学分析。定量资料以均数±标准差（x±S），多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。应用Kaplan-Meier曲线计算生存率，应用Log-rank检验比较不同组的生存曲线。定义P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1小鼠的一般情况Control组小鼠活泼好动，呼吸均匀，毛发有光泽。LPS组小鼠精神差，活动明显减少，眼角有脓性渗出，部分伴腹泻及鼻出血，呼吸加速，双腿蜷缩，反应迟钝，毛发凌乱。LPS+fasudil组及LPS+Dex组小鼠的一般精神状态明显好于LPS组。2.2小鼠生存率造模后，根据时间推移统计每组小鼠的生存情况，记录每只小鼠的生存时间，绘制生存分析曲线。结果如图所示（图1），动物死亡主要发生在24-72h，72h后则死亡较少。同时行Log-rank方法比较不同组之间的生存率有无差异，结果表明Control组动物无死亡，LPS组较Control组生存率明显减低（P0.05），fasudil和Dex可显著提升LPS诱导的ALI小鼠生存率（P0.05）。2.3血清TNF-α、IL