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溶液溶菌酶混合液:2mg/mL溶菌酶、50µg/mLRNase、0.3mol/L蔗糖、25mmol/LTris-HCI(PH8.0)、25mmol/LEDTA(PH8.0);氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液:配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备用。甘露糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水D-甘露糖1.000g,加水溶解,定容至100ml。乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解,定容至100ml。乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解,定容至100ml。氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g。加水溶解,定容至100ml。乙酸-乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解,定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.5。0.5%魔芋精粉底物:称取0.5g魔芋精粉加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌,同时缓慢加热,直至魔芋精粉完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml。)。然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液定容至100ml,使用前适当摇匀。4℃避光保存,有效期为3天。DNS试剂:称取3,5-二硝基水杨酸3.15g,溶于500mL蒸馏水,水浴至45℃,搅拌,然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液,同时不断搅拌,直到溶液澄清透明(加入氢氧化钠过程中温度不要超过48℃),再逐步加入酒石酸钾钠91g,苯酚2.5g,亚硫酸钠2.5g,维持45℃,同时补水300mL,不断搅拌直到完全溶解。冷却后,定容至1000mL。避光保存,静置一周,待用。10×微量元素溶液(PTMl):CuSO4·5H2O6g/L,,NaI0.08g/L,MnSO4·H2O3g/L,NaMnO4·2H2O0.2g/L,H3BO30.2g/L,ZnCl220g/L,CoCl20.5g/L,FeSO4·7H2O65g/L,生物素0.2g/L,浓硫酸2mL/L。过滤除菌,保存于4℃,用于补加到基础盐培养基和其它补料成分之中。基础培养基添加量为4.8‰,补料使用时添加量为12‰。染色液:考马斯亮兰R-2502.5g,甲醇454mL,冰醋酸92mL,水454mL。脱色液:甲醇456mL,冰醋酸72mL,水472mL。酶活测定(参照国际标准)2.2.10.1甘露聚糖酶活力单位定义在37℃、pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖(SigmaG0753)溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。2.2.10.2测定原理甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。2.2.10.3标准曲线的绘制吸取乙酸-乙酸钠缓冲液4.0ml,加入DNS试剂5.0ml,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样。分别吸取甘露糖溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml,分别用乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100ml,配制成浓度为0.10-0.70mg/mlD-甘露糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml(两个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂。电磁振荡3s,沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值。以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。2.2.10.4试样溶液的制备粗酶液直接用乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行稀释、定容(稀释后的酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.04-0.08u/ml之间)。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节、校正至5.5,然后再用缓冲溶液做适当定容。2.2.10.5测定步骤(1)将上述稀释后的酶液和0.5%魔芋精粉底物分别放入50℃水浴锅,平衡10min。(2)吸取2.00ml稀释后的酶液,加入到25mL比色管中,再加入5mlDNS试剂,电磁振荡3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液,50℃保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB。(3)吸取2.0ml经过适当稀释的酶液,加入到刻度试管中,再加入2.0ml甘露聚糖溶液,电磁振荡3s,50℃精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂,电磁振荡3s,酶解反应。沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE。2.2.10.6酶活的计算利用一下公式对酶活力进行计算:[(AE-AB)×K+CO]XD=×1000(1)M×t式(1)中:XD—试样稀释液中的甘露糖聚酶活,u/ml;AE—酶反应液的吸光度;AB—酶空白样的吸光度;K—标准曲线的斜率;CO—标准曲线的截距;M—甘露糖的分子量(180.2);t—酶解反应时间,min;1000—转化因子,1mmol=1000umol。XD值应在0.04-0.08u/ml之间。如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定。X=XD·Df(2)式(2)中:X—试样甘露聚糖酶的酶活,U/mL;Df—试样的总稀释倍数。酶活的计算值保留三位有效数字。分别用2mL浓度为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mg/mlD-甘露糖标准溶液和5mlDNS试剂沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值(表4-1)。以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线(图4-4)。表4-1标准曲线的绘制Table.4-1thenormalcurvepictureD-甘露糖浓度(mg/mL)0(CK)0.100.200.300.400.500.600.70OD54010.01420.03340.15680.28300.38920.52060.64620.755920.01410.03340.15680.28300.38930.52060.64620.755830.01430.03350.15680.28310.38930.52060.64630.7558平均值0.01420.03340.15680.28300.38930.52060.64630.7558重组酵母酶活测定重组酵母Man和syn-Man分别进行100mL摇瓶产酶发酵,每12h添加甲醇至终浓度为1﹪,每24小时取粗酶液测一次酶活。结果如下表4-2:表4-2不同发酵时间段酶活力的测定Table.4-2EnzymeactivityexpressingManandsyn-Manatdifferentfermentationtime.发酵时间24h48h72h96h120h酶活力(U/mL)Man15.3720.4136.6351.8193.28syn-Man54.8970.14344.22379.42479.01
本文标题:甘露聚糖酶活测定
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