第六章-染色体工程

染色体工程染色体变异与染色体工程染色体变异可体现在染色体数目和结构两个方面。染色体数目能以个体或以染色体组为单位的增加或减少。A-染色体易位B-染色体缺失C-染色体倒位D-染色体重复染色体结构变异染色体工程技术的出现染色体变异在自然界里经常发生，但是频率较低。为了增加变异的几率，可以利用各种物理（如射线、超声波、高温等）和化学药剂（如秋水仙素等）人工诱发染色体变异，这样得到的诱发频率要高出自然突变几率的几百倍甚至几千倍。于是出现了染色体工程这门技术。染色体工程技术定义按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的目的。广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。这一术语最早是由Rick和Khush在1966年提出来的。多倍体多倍体(Polyploid)是由Winkler于1916首先使用的，它是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体。常见多倍体有三、四、五、六和八倍体。多倍体与二倍体相比，最显著的特点是形态上的巨大性，代谢更为旺盛。此外，糖类、蛋白质及其它产物的含量也有所提高。由于多倍体动物具有生长速度快、成活率高及抗病能力强等特点，所以，可通过人工诱导多倍体来改善动物经济性状。多倍体产生的途径（1）原种或杂种所形成的未减数配子（即配子内保持原种或杂种的合子的染色体数）的受精结合。（2）原种或杂种的合子的染色体加倍。多倍体育种多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，如通过抑制受精卵第二极体的放出产生三倍体或抑制第一次卵裂产生四倍体。目前广泛应用的诱导方法有生物学、物理学和化学方法。其中物理方法主要用于多倍体育种史的初期，现已不常用；生物方法是随着组织培养技术发展起来的新技术，尚不成熟。这两种方法由于加倍的效率低而很少使用。目前最普遍采用的方法是化学试剂诱导法，其中秋水仙素则是至今发现的最有效、使用最为广泛的染色体加倍诱导剂。生物学方法主要包括体细胞杂交等。如三倍体动物可通过杂交产生。物理学方法主要包括温度激变（温度休克法）、机械创伤、电离辐射、离心、水静压法和高盐高碱法等。化学方法利用一些化学物质也可以阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。常用的化学物质主要有：细胞松驰素B（Cytochalasin）：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。诱导多倍体形成的其他药物还有麻醉剂如N2O、CHClF2和聚乙二醇等。秋水仙素秋水仙素则是至今发现的最有效、使用最为广泛的染色体加倍诱导剂。是从一种百合科秋水仙属植物器官中提取的一种生物碱。秋水仙素（Colchicine）：可以抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而可以抑制有丝分裂。这种方法已在植物多倍体诱导中广泛使用。也可用秋水仙素与种间杂交技术相结合来诱导异源多倍体。能特异性地与细胞中的微管蛋白质分子结合，从而使正在分裂的细胞中的纺锤丝合成受阻，导致复制后的染色体无法向细胞两极移动，最终形成染色体加倍的核。在一定浓度范围内，秋水仙素不会对染色体结构有破坏作用，在遗传上也很少引起不利变异。处理一定时间的细胞可以在药剂去除后恢复正常分裂，形成染色体加倍的多倍体细胞。处理技术处理部位：只有处理正在分裂的细胞才能获得多倍体。通常以植物茎端分生组织或发育期的幼胚为材料。处理方式：秋水仙素一般用水溶液，也可混入羊毛脂、琼脂或凡士林中。可根据不同情况选择以下处理方法：浸渍法、涂抹法、棉花球滴渍法、喷雾法、注射法、药剂培养基法等。药剂浓度：不同植物对秋水仙素的敏感性不同。实践证明，秋水仙素的有效浓度一般在0.01-0.4%，以0.2%左右的浓度最为常用。处理时间：一般不少于24小时。浓度高时处理时间可相应短些。处理温度：一般在18-25℃之间。多倍体倍性鉴定的方法染色体计数法由于染色体制片技术比较成熟，因此染色体计数仍是目前鉴定多倍体倍性的一种最为直观、准确的方法，但缺点是比较费时。DNA含量测定细胞DNA含量测定是倍性鉴定的另一个比较有效的直接鉴定的方法。如：如果发现杂种的DNA含量是其亲本的一倍半，就可以确定这些杂种是三倍体。是较为先进常用的方法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但是缺点是这种仪器比较昂贵。多倍体育种的重要应用多倍体较之二倍体具有较好的经济性状。三倍体无籽西瓜培育原理三倍体西瓜是利用秋水仙碱处理普通二倍体西瓜，使染色体数目加倍形成同源四倍体，然后用同源四倍体西瓜为母本与二倍体西瓜为父本杂交获得同源三倍体。由于三倍体的同源染色体组有3个，在减数分裂后期配子染色体组合成分的不平衡，使染色体不能正常联合，导致同源三倍体的高度不育，即在果实内没有种子。三倍体无籽西瓜的育种过程无籽西瓜的果实由于没有籽、品质好、食用方便、高产抗病、耐贮运等优点而深受生产者、经营者和消费者欢迎。目前生产上栽培的无籽西瓜是三倍体西瓜。它是由四倍体西瓜作母本，二倍体西瓜作父本进行杂交而产生的一代杂种。具体步骤（1）四倍体母本的获得：取二倍体西瓜的幼苗，用0.2-0.4%的秋水仙素溶液滴在幼苗的生长点上，每天1-2次，连续2天，可以获得四倍体。（2）三倍体获得：选择优质高产的带有显形基因标志的二倍体作父本，与四倍体母本植株杂交获得三倍体种子。（3）无籽西瓜的获得：将三倍体种子种下，长出三倍体植株。由于三倍体无籽西瓜不能合成生长素促进无籽果实的发育，所以需要用正常二倍体植株的花粉授粉，促使无籽果实发育。存在问题与展望（一）首先需要找到一种更适宜的诱导剂。虽然现已发现除草剂具有使染色体加倍的功能，但与秋水仙素一样属于生化制品，价格昂贵而且对生物体有毒。（二）嵌合体现象还不能完全克服，真正同一倍性的多倍体出现的几率不是很高。（三）判定是否是多倍体的一些特性评价的准确性。（四）在遗传上具有高度杂合性的多倍体过剩遗传信息对多倍体遗传效应的贡献究竟有多大。（五）多倍体诱导技术在育种上的应用还不完善，还需要开展广泛的研究。单倍体不论细胞本身含有几个染色体组，只要细胞中含有正常体细胞的一半染色体数，即具有配子染色体数目的个体都叫单倍体。单倍体及其它体细染色体组数为奇数者(如三倍体、五倍体)均表现高度不育，原因在于其无法实现正常的减数分裂。单倍体优点（一）由于单倍体只具有一套染色体，染色体上的每个基因都能表现相应的性状，所以极易发现所产生的突变，尤其是隐性突变，所以单倍体是研究基因或基因剂量效应，进行染色体遗传分析的理想实验材料。（二）由于通过人工方法使单倍体的染色体加倍就可以获得纯合二倍体，因此在育种上具有极高价值。具体特点（一）可以克服杂种分离的困难，缩短杂交育种时间，一般只需一年就可迅速获得自交系，两年就可获得纯系。（二）大大提高选育效率，若按照理论推算，效率较常规育种的效率提高2000多倍。（三）能克服远缘杂交的不孕性，创造出新物种。单倍体育种技术花药培养生成单倍体加倍植株的过程具体过程（一）花粉的获得：剪下处于单核中期的花粉的小麦穗子。（二）花药制备与培养：剪掉叶子，只留叶鞘，将穗子插入有水的烧杯，放在4℃冰箱预先处理3-5天。然后用70%的乙醇擦拭叶鞘，在无菌条件下剥取花药，接种于适当的培养基中，25-28℃条件下培养。（三）愈伤组织培养：当愈伤组织长到1.5-2.0毫米时转移到含奈乙酸、蔗糖等成分的培养基上，于25℃、光照条件下培养。（四）移栽：当愈伤组织长出根系后，把苗从培养基中取出，移栽于土壤中。（五）染色体加倍获得二倍体：当花粉植物处于分蘖盛期时，从土壤中取出植株，浸入0.02%的秋水仙素溶液中，于10-15℃下、散射光照处理2-4天，洗去药液，栽入土中。这样长成的植株就是二倍体小麦。雌、雄核发育雌核发育（Gynogenesis），俗称假受精，意指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子在染色体中很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行的一种发育方式。雄核发育（Androgenesis）是指因经过紫外线、X射线或γ射线处理后的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育成完全为父本性状的二倍体。雌核发育技术——单亲纯合双倍体动物育种单亲纯合双倍动物育成技术又称为这是一种相当于植物中由花粉培育成纯合双倍体植株的技术，其结果都是培育出具有两套完全一致的染色体及基因的个体。意义雌核发育为生产具有产生单性种群提供了可能。还能迅速地产生同源型二倍体克隆。这不仅在选择育种工作上具有重要性，而且也为基础生物学研究提供了一种优越的研究品系。具体步骤首先将两个不同品系的的近交系进行杂交后，在精核与卵核尚未融合之前，从母鼠子宫内冲取受精卵并用极细的吸管将雄核去掉。然后在细胞松驰素B的处理下使雌核加倍，形成二倍体细胞，二倍体细胞在体外继续培养到胚囊期后，移植到养母的子宫内使胚胎继续发育，直至出生。染色体显微操作技术与微克隆技术染色体显微操作技术主要包括染色体的分离与微切割技术，其优点是可以根据需要分离任意一条染色体或特定染色体片段。将分离到的染色体或片段进行体外扩增称为染色体微克隆。细胞核融合转移法细胞融合技术,其实也是整套染色体转移而互相融合的一种技术。下面以嵌合体小鼠的育成为例介绍一下细胞核融合转移法的具体方法与过程。具体步骤（一）首先用两对不同品系的近交系小鼠在同一时刻进行纯交。为了使其后代便于区分，常选择毛色不同品种的近交系小鼠例如选用白毛的SJL小鼠与黑毛色的BL/10小鼠。（见图中步骤1）（二）当受精卵分裂为8分裂球时，分别将它们从各自母体的子宫上分离下来。然后用蛋白酶消化分裂球外面的明带，使分裂球“裸露”。（见图中步骤2和3）——裸露胚胎（三）在37℃的条件下，将来自两个品种的两个分裂球彼此接触，任其粘成一个具有双倍体积的早期胚胎。（见图中步骤4）（四）将早期胚胎继续培养到具有128～256个细胞的胚囊。这时，不同毛色品系的细胞相互混杂发育在一起。（见图中步骤5）（五）然后，通过手术把胚囊移植到寄养母鼠的子宫内，让它继续发育，直至出生。（见图中步骤6）（六）新生小鼠长出毛后，其毛色表现为既不象父亲SJL品系的全白色，也不象母系BL/10品系的全黑色，而是表现出黑、白条或块状的毛色。这说明新生鼠的组织是由“黑色”细胞和“白色”细胞嵌合而成的，是一只嵌合体小鼠。（见图中步骤7）课堂讨论利用细胞融合技术，你最想获得怎样的生物？为什么？会不会影响自然物种的安全性？你认为细胞融合或染色体工程技术在应用性和遗传学研究两个意义中哪个更重要？为什么？下课了