各突变检测方法比较

实用文档大全1、RNA酶A切割法（RNaseAcleavage）在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30％，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70％。该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。电泳法（不能确定突变位点，都要通过测序等解决）2、变性梯度凝胶电泳（DGGE）双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain,MD)和解链行为(meltingbehavior)。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30-50个碱基对）可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链浓度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。3、PCR-SSCP法单链构象多态性单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)是一种分离核酸的技术，可以分离相同长度但序列不同的核酸（性质类似于DGGE和TGGE，但方法不同）。实验步骤利用PCR从提取出的DNA中扩增16SrRNA基因。利用λ-外切核酸酶消化掉一条链（其中一个PCR引物被磷酸化，这条链将被去除）。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。应用：单链构象多态性可用于预筛选克隆文库。可对其中的某一个条带进行测序，并与数据库中已知序列比对。原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使是一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移率。4、杂合双链分析法(HA)由突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一个凸起,在非变性胶中电实用文档大全泳时,会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率,从而使两者被分离开。该方法原理与单链构象多态性(SSCP)相似,只不过SS-CP分离的是单链,而HA法分离的是双链。HA法简单迅速,但只适用于200～300pb的片段,且不能确定突变位置,检出率只有80%左右,有人建议将HA法和SSCP法联合使用,可能将检出率提高到接近100%,也有科研工作者建议使用缺失的野生型等位基因来提高该方法的灵敏度。5、化学切割错配(CCM)化学切割错配是在Maxam-Gilbert测序的基础上发展起来的一项突变检测技术,在DNA∶DNA或DNA∶RNA异源杂合双链核酸分子中,错配的C能被羟胺(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,错配的T能被四氧化锇(Osmiumtetroxide)所切割,切割产物跑变性胶电泳即可确定是否存在突变。只要操作得当,不会发生非特异性切割,如果对正义链和反义链都进行分析,可使检出率达到100%;使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度,从而可检测出十个细胞中的一个突变细胞。该方法的最大优点是能对长至2kb的片段分析,并能确定突变位置,缺点是步骤多,费时,且需接触有毒的化学物质。6、碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI)与CCM法相似,CDI能够对错配的G和T进行修饰,当用标记的引物对CDI修饰过的双链DNA进行DNA合成时,延伸会在修饰过的碱基处终止下来,合成产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测出是否有突变。该方法的最大优点也是能对1～2kb的片段进行分析,突变检出率达到100%,能确定突变位置,并且CDI是一种没有毒性的物质,有报道曾用该法检测出了7.2kbDNA片段中的一个点突变,但当一个DNA片段中存在多个突变时,该方法就不适用。7、酶促切割错配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)EMC是一种与RNaseA切割相类似的方法。T4核酸内切酶是一种分解酶(resolvase),能够识别12种错配的碱基并在错配碱基的附近进行切割，酶切产物跑变性胶或中性胶即可检测出是否有突变，电泳产物的检测可用放射自显影，也可用银染。由于该法能对DNA∶DNA异源杂合分子进行分析，因而省去了体外转录的步骤，其最长检测片段可达到1.5kb，该法的缺点是存在非特异性切割现象，并且对有些错配碱基的识别不是100%，因此在每次检测时都必须设有一个内对照。8、限制性片断长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)连琐分析技术RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。RFLP技术主要包括以下基本步骤：DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1%才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。发展：反向限制性位点突变分析（iRSM），进行低突变频率等位基因的检测。其方法主实用文档大全要用于突变早期的检测，当某一野生型序列发生突变导致原有酶切位点（E1位点）的消失，产生一新的酶切位点（E2位点），称之为E1→E2突变，但突变频率较低常规RFLP无法检测。此时，用一内切酶(E1)对其进行酶切，这样可选择性地移去大部分的野生型序列（99%）。无酶切位点的部分通过PCR扩增（引物被设计在E2位点的一侧），产物用另一内切酶（E2）进行RFLP分析，根据产物中是否存在E2位点即可判断有无突变发生。由于该方法在RFLP分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化，减少了野生型序列的含量（一般消化率99%），因而大大提高了突变序列的检出率。值得注意的是：只要选择适当的限制性酶切位点，此项技术适应于任何基因、突变或生物体。但是，由于聚合酶的关系，可能在PCR扩增后导致iRSM分析出现假阳性。这可以通过使用高保真聚合酶进行修正；同时为了提高检出率，iRSM分析可于其它分析技术联合使用或增加目的基因的含量。9、切割片段长度多态性(CleavageFrag-mentLengthPolymorphismCFLP)CFLP技术是在限制性酶切片段长度多态性(RELP)和SSCP基础上发展起来的一种基因突变检测技术，其原理是:双链DNA变性后形成的单链在中性条件下形成二级结构(包含多个折叠的发夹状结构),正如SSCP一样,这种二级结构取决于DNA的核苷酸组成和顺序,即使有一个碱基的差异,也会形成不同数目的折叠状发夹结构,而CleavaseI外切酶能识别这种发夹结构,并在该结构的附近进行切割,切割产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶检测,突变的DNA将出现与正常对照不同的酶切图谱。10、PCR-ELISA结合微测序检测点突变（PCR-ELISA&mini-sequencing）新近有报道称：使用PCR-ELISA结合微测序检测到无临床症状且未经抗病毒药物治疗的乙肝患者HBV基因的YMDD主题突变区存在天然Lamivudine耐药基因。其检测原理如下：探针结合区野生型HBV基因序列：5-…739ATACGG744A…-3′,针对突变区域设计的探针，Wild-Probe:5-…ATACGG-3′；Val-Probe:5-…ATGTIG-（针对741～742位点突变，743位点设计摆动配对）；Ile-Probe:5-…ATATAG-3′、5-…ATATCG-3′、5-…ATATCG-3′（针对743位点突变）。变性的扩增产物与上述3种类型探针杂交后，再加入含生物素-7-dATP、Taq酶和Mg2+等的微测序缓冲液55℃温育。如果Val或Ile探针与靶DNA完全匹配，探针3′末端延伸一个带标记的腺嘌呤。反之，不匹配时，探针Tm降低，3′末端游离而不延伸标记的腺嘌呤。利用链酶亲和素酶标系统检测探针上标记的生物素，可判断样品中是否存在点突变。而近期我们所进行的点突变检测是基于PCR-ELISA和杂交链稳定性的基础上发展起来的，主要是利用野生型和突变型序列与探针结合后在Tm值上的差异进行检测。近年来随着新技术、新材料的不断涌现，已知基因单位点突变检测技术将会得到迅速的发展，从而距离理想的突变扫描方法（即：对大片段DNA进行突变扫描，100%的检出率，无假阳性或假阴性现象，不需复杂的设备、花费低、不需使用有害试剂和同位素、高效率、耗时短。）越来越近。11、变性高效液相色谱分析（denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC）优点：高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等。在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下实用文档大全来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。DHPLC高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化DNA片断。当然，只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是这可以利用混合的方法（即将纯合突变样品和野生型样品混合）来解决。在很多的研究中，DHPLC色谱图有改变的样本经测序均显示DNA有变异；在我们的前期工作中曾用该方法检测了大量样本，特异性及敏感性均接近100%，提示该方法是一种高效、可靠的突变检测方法。该方法的不足之处是无法得出具体的突变位点及突变类型，还需DNA测序方法证实。12、DNA测序(Sequencing)由各种突变检测技术检测到的突变最后都得由测序来确定突变类型及突变位置,而且测序法检测突变的效率达到100%。但缺点是花费昂贵,所以对一些较大的,外显子较多的基因不宜用测序法直接检测突变,同时也不适用于临床对大量的标本进行检测,此外,测序也不能被当成是突变检测的金标准,杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据。Sanger法测序：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使