质粒载体的构建

质粒载体的构建－菜鸟入门手册dongkey制作本人刚刚完成质粒载体的构建，总结了一下，以方便要做这方面的菜鸟同学借鉴一下，希望老鸟同学批评指教。一、确定插入的基因片段。首先要确定自己要插入载体中的基因片段，比如要做蛋白表达和功能，可以选择CDS区进行插入。然后自然是如何得到这段基因片段的问题了。最常见的是PCR解决了。那么就涉及到引物的设计。插入CDS基因片段的例子：找到CDS，根据CDS设计全长引物，然后加上内切酶的碱基片段（这要根据自己手头上有的质粒的内切酶位点来决定了），注意，前面要加上保护碱基！然后进行PCR。PCR后要跑电泳确定目的基因的长度是正确的。用乙醇沉淀法纯化PCR产物（具体见分子克隆一书）菜鸟体贴提示：要在质粒上找到两个最好不是连续在一起的内切酶，然后分别添加在两条引物的5‘端，当然内切酶的温度最好是一致的，而且可以能够同时切开的（双酶切）。这可以在试剂公司的限制性内切酶的列表上找到有没有共同的BUFFER及其双酶切时的活性如何（当然是越大越好了）。内切酶的公司一般可以找NEB,TAKARA,TOYOBO等公司，本人用的是TAKARA。二、酶切将质粒和基因片段分别进行酶切。最省事的是同时双酶切了。一般酶切温度都是37度。菜鸟体贴提示：1、确定质粒和基因片段的量！！（宁少不多），根据说明书加样，一般是DNA＋BUFFER＋加内切酶。注意BUFFER的比例，有的是1×，有的是1.5×。2、确定内切的时间。这是比较讨厌的环节。切的时间不能短，也不能太长。最好是做一个梯度。注意，说明书的内切时间不一定就是标准的！！（本人经验是可以稍微切的时间长一点，也不用短了）3、确定酶切成功了。对于质粒，可以将空质粒和切开的质粒同时电泳跑，对比一下就知道了对于目的基因，很难，因为切开的是几个碱基而已，不过一般如果质粒切开，目的基因应该也会被切开的。酶切完成后，有两种方法回收1、电泳跑胶回收2、不跑胶，直接用纯化试剂盒回收。根据N多种理论，很多人建议用第一种方法较好。理由这里就不罗列了。三、感受态大肠杆菌的制备。这里建议按照分子克隆的CaCl方法进行制备（书上已经详细列出了步骤，菜鸟也能做的）。感受态的好坏关系到转化效率，因此要认真对待。不过貌似也不是很难。保存要在－80度保存，也有某位仁兄告诉我4度放一放效果更好，没有试过，书上都是－80度的。当然，放的太久转化效率会随时间而减弱。如果有钱的同学就不需要费那么多功夫了，直接买就是了。本人是买TAKARA的，300大洋，10支。四、连接很多公司都有快速连接试剂盒和普通试剂盒。一般都是16度数个小时或者过夜，或者4度过夜，不一而同。曾在园子里看到一个高人的文章，认为是时间越长越好，甚至建议4度放几天，我没有试过。16度可以用PCR仪创造，或者找一个泡沫盒，加上冰，水搞到15度左右，放入4度冰箱即可。我用的TAKARA的快速连接试剂盒，4度过夜。菜鸟体贴提示：1、通过电泳，粗略判定质粒和DNA的浓度比例。一般加入连接液的DNA:质粒＝9：12、放入质粒和DNA的总量要适当，不可超过说明书，宁少不要多。五、转化按照分子克隆的步骤来。如果是买公司的感受态，根据公司的说明书。菜鸟提示：1、复苏的时间一定要掌握好，还有是装感受态的管子要薄，以有利于温度的传导。一般用恒温水浴。2、涂抹在培养皿上的时候，可以做一个梯度，200ul，300ul，400ul，一定要晾干。六、确定测序的克隆。一般在培养皿上挑10－30个左右的单克隆。加入培养液（含抗生素）过夜培养，后用2ul的培养液，加上步骤一的引物，进行PCR，电泳，看有没有目的基因的条带。然后将有条带的培养液提取质粒，双酶切，电泳看看有没有目的基因的条带。如果有的话，可以送去测序了。菜鸟提示：1、可以绕过PCR直接提取质粒酶切（如果挑的克隆太多的话，建议还是先PCR以缩小范围）。2、如果目的基因较小的话（如100－300bp），那么酶切后电泳加样要尽量多一点，因为切下来的目的基因的亮度对比质粒的亮度是100－330/数千bp分之一。七、测序结果的分析可以使用多种软件。这里不罗列了。菜鸟方法：一般公司发回来的有记事本或者WORD的排列好测序结果的序列。将它们复制到一个新的WORD文档中，调整好格式，如全部大写，没有空格，没有回车符号等。然后，将目的基因全长COPY，使用查找功能，看是否全符合。