芽孢杆菌分离筛选与培养

1芽孢杆菌分离筛选与培养枯草芽饱杆菌是芽饱杆菌属的模式种，很少成链，通常为0.7~0.8μm×2.0~3.0μm，营养细胞杆状，杆端钝圆，单生或成短链，能运动，革兰氏染色一致呈阳性，芽孢中生或偏生，芽孢呈椭圆或长简形。无荚膜，周生或侧生鞭毛，游离孢子表面着色弱，菌落形态变化较大，粗糙，表面干燥，不透明，灰白色或微带黄色，扩散（蔓延）生长。斜面丰厚粗糙，不透明，蜡质蔓延，奶油色至微褐色。在液体培养基表面形成银白色较厚的具皱纹的菌膜。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，广泛分布在土壤、水体及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。琼脂培养基上的菌落圆或不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色，菌落的形状随培养基成分不同而有很大变化。当琼脂培养基表面潮湿时，菌落易于扩散。在琼脂培养基上生长的菌苔在液体中不易扩散。在培养液中生成色暗、皱褶、完整的膜，培养液轻度混浊或不混浊。有氧时生长旺盛，在含有葡萄糖的复杂培养基中可进行厌氧代谢，但其生长和发育都较弱，生长温度最高为45~55℃，最适为37℃。枯草芽孢杆菌生理生化特性：液化明胶冻化牛乳还原硝酸盐不产生吲哚，硫化氢V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧。地衣芽孢杆菌孢囊不膨大，无伴孢晶体，中生卵圆型芽孢，周围鞭毛，无荚膜。革兰氏液染色呈紫色阳性菌。细胞大小一般在0.9~1.2×2.2~3.8微米。菌落呈灰白色、边缘不整齐的扁平菌落。1.样品：外购菌种商品微生物制剂（固体或液体）土壤水体或枯枝烂叶，腐烂稻草（记录取样位置PH植被情况等）。2.菌种分离与纯化2.1．培养基2.1.1可溶性淀粉3g/L蛋白胨10g/L酵母膏3g/LKH2PO41.5g/LK2HPO42g/LMgSO40.1g/LPH7.4—7.6（富集用）2.1.2肉汤（NA）培养基（营养琼脂）：蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaCl5g/LPH7.2—7.4（保存计数或分离纯化用）营养琼脂：麦芽汁培养基=1：1混合使用，菌落不易扩散，形态特征典型2.1.3蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖3.5g/LNaCl5g/LK2HPO40.5g/LMgSO43g/LMnSO425mg/LPH7.2—7.4（分离纯化用）2.1.4产淀粉酶菌株筛选培养基：可溶性淀粉3-5g/L蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaCl5g/LPH7.2—7.4（用于淀粉酶产生菌分离筛选）2.1.5产蛋白酶菌株筛选培养基2.1.5.1酪素培养基：2★★2.1.5.1.1葡萄糖1g/L，酵母膏1g/L，酪素4-5g/L，K2HPO41g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.1g/L蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2。另：葡萄糖0.5g/L，酪素10g/L，NaCl5g/LK2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，琼脂20g/LpH7.2-7.42.1.5.1.2牛肉膏3g/L或酵母浸粉5g/L酪素10g/LNaCl4-5g/LPH7.2—7.4先将酪素用少量2%氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解（10-15min），补足1000mL蒸馏水，加入其他成分，调PH分装灭菌。2.1.5.1.3酵母膏0.05g/L酪素4g/LKH2PO40.36g/LNa2HPO41.1g/LMgSO40.5g/LNaCl0.16g/LFeSO40.002g/LCaCl20.002g/LZnCl20.014g/LpH6.5-7.04℅酪素母液制备：4g酪素溶解于0.1N的30-35mL的氢氧化钠溶液中，水浴溶解20min，溶解完毕后加入60-70℃热水定溶到100mL.200mL培养基加20mL.★★2.1.5.2脱脂奶培养基：牛肉膏3g/L（酵母浸粉5g/L）蛋白胨10g/LNaCl5g/L脱脂奶粉10-12g/L，PH7.2（用于蛋白酶产生菌的筛选）将脱脂奶（粉）加水溶解制成10℅溶液，于115℃加热灭菌20-30min，与牛膏蛋白胨固体培养基1：9混合均匀倒平板。2.1.6纤维素产生菌培养基：CMC-Na2g/L蛋白胨10g/L酵母膏5g/LNaCl5g/LPH7.2-7.4（用于纤维素产生菌的筛选）2.1.7促芽胞形成培养基：土壤浸出液1000mL蛋白胨5g/L牛肉膏6g/LPH7.2—7.4蛋白胨1g/L酵母膏0.7g/L葡萄糖1g/L(NH4)2SO40.2g/LMgSO40.2g/LK2HPO41g/LPH7.2—7.4（分离纯化用）产芽孢培养基：蛋白胨10g/L牛肉膏3-5g/LNaCl5g/L.玉米粉0.5g/L酵母膏0.1g/LPH7.2—7.42.1.8产蛋白酶发酵培养基：玉米粉30g/L豆饼粉20g/L麸皮10g/L磷酸二氢钠4g磷酸二氢钾0.3g/L碳酸钠1.0g/LPH7.4—7.6八层纱布塞，牛皮纸扎好。2.1.9产淀粉酶发酵培养基：玉米粉40g/L豆饼粉20g/L蛋白胨5g/L硫酸铵4g/L磷酸二氢钠8g/L磷酸二氢钾3g/LPH7.4—7.6八层纱布塞，牛皮纸扎好。产酶培养基（蛋白淀粉酶）：蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖1g/L可溶性淀粉5g/L磷酸二氢钾2g/LMgSO40.5g/LCaCl20.2g/LPH7.0-7.42.2分离纯化（或复壮）2.2.1冻干管的活化及菌种复壮：活化：用无菌吸管吸取0.5mL无菌水滴入安管中，轻荡使干菌体溶解成菌悬液，做梯度稀释后取0.1-0.2mL涂布或直接划线于肉汤（麦芽汁）培养基平皿，或转接于斜面（活化）37℃24-36h。复壮：挑取选择生长快，菌落大的菌落于4.5mL无菌水试管中，振荡摇匀后置于80℃水浴加热15-20min，梯度稀释后涂布于促芽胞形成培养基平皿或蘸取菌悬液直接划线，37℃24h。反复二至三次，选取平皿上菌落大而且生长快的菌落转接于斜面37℃18-20h，4℃冰箱保存。32.2.2商品微生物制剂中菌种选育1g（1mL）商品制剂加入99mL无菌（生理盐）水/250mL三角瓶（带玻璃珠），置于摇床振荡20-30min，80-85℃水浴加热15-20min，进行梯度稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，根据活菌含量选取两至三个梯度进行混菌或涂布35℃-37℃24h，挑取一环生长快，菌落大的不同典型菌落分别转接5mL无菌水试管中，混合器混合5-10min，做成菌悬液梯度稀释后混菌或涂布，或直接蘸取菌悬液直接划线，37℃18-20h。结合镜检直到菌落大小基本一致，转接于斜面37℃18-20h，于4℃冰箱保存。或将梯度菌液1mL加入平板，然后分别注入淀粉和酪素培养基中，30-37℃24-48h，挑取D/d大的（淀粉培养基加碘液，观察透明圈）转接于斜面备用或用划线法进行纯化。并通过染色镜检观察，从菌落形态和细胞形态进行鉴别。2.2.3自然筛选2.2.3.1富集培养：取5g底泥或肠道内溶物0.5g，加入45（50）mL无菌水/250mL三角瓶（带玻珠）中，振荡15-20min，取5mL菌悬液或5mL水样加入45mL促芽培养基/250mL三角瓶中，75℃-80℃水浴15-20min，降至35℃-37℃150-200r/min振荡24h，染色镜检，连续两至三次培养备用。或取1g底泥（土）置于20mL肉汤培养基/250mL三角瓶，八层纱布封口，75℃-80℃水浴处理15-20min，然后150-200r/min振荡24h。镜检形成芽孢情况，挑取具有芽孢的菌落进行划线纯化培养，获得单菌落。2.2.3.2分离纯化取富集菌液置于75℃-80℃水浴15-20min，梯度稀释10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，选择三个合适的梯度混菌或涂布于营养琼脂麦芽汁培养基或直接涂布于酪素培养基上初筛，也可划线分离（划线法先将平板置于30℃（24-48h）或37℃（18-24h），无菌检查，表面冷凝水干燥）。每个梯度二个平皿，将平板倒置，于35℃-37℃24-48h。对长出的单菌落进行编号，选择生长快、菌落大，表面干燥，粗糙，不透明的菌落转接于斜面备。挑取少许菌苔涂片，做芽胞染色判断是否为芽孢杆菌。2.2.3.3菌种筛选：蛋白酶产生菌株筛选：操作程序：样品溶解稀释—热处理（75-80℃）--梯度稀释—平板涂布培养—单菌落编号（转接斜面）--镜检（涂片芽孢染色）--初筛（点接酪素平板）—复筛（接产酶培养基培养，离心取清液蛋白酶活力测定）--转接斜面保藏。一般选择菌株表面干燥粗糙不透明，作为目标菌。以判定为芽胞杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔做成菌悬液，划线于或适当稀释涂布于酪素平板，35℃-37℃24-48h，菌落周围出现透明圈，挑取C/H大菌，转接于斜面或进行复筛。产蛋白酶发酵培养基35℃-37℃振荡培养24-48h，发酵过滤或离心，取清液检测蛋白酶活力进行复筛。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶的活力有很大差异，有的活力大于4000U/ml。C/H大菌落，其蛋白酶不一定大，因此，对初筛C/H大菌落进行发酵培养，取发酵液进行酶活测定进行复筛。淀粉酶产生菌株筛选：样品溶解稀释—热处理（75-80℃）--梯度稀释—平板涂布培养—单菌落编号（转接斜面）--镜检（涂片芽孢染色）--初筛（点接淀粉平板-滴加碘液）—复筛（接4产酶培养基培养，离心取清液淀粉酶活力测定）--转接斜面保藏。一般选择菌株表面干燥粗糙不透明，作为目标菌。以判定为芽胞杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔做成菌悬液，划线于或适当稀释涂布于淀粉平板，35℃-37℃24-48h，取0.02mol/l碘液或卢戈氏碘液滴加在淀粉平板中菌落周围，观察形成透明圈的结果，挑取C/H大菌，转接于斜面或进行复筛。接入产淀粉酶发酵培养基35℃-37℃振荡培养48h，发酵过滤或离心，取清液检测淀粉酶和糖化酶活力进行复筛。菌种鉴定：染色显微镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。菌落扁平，圆形或近圆形，表面粗糙，乳白色。镜检菌体杆状，单个或链状，革兰氏染色阳性，芽孢圆形或柱型，中生或近中生。菌株的糖醇利用，产酸产气，生长温度，酸碱度PH，耐盐试验（7℅），溶菌酶抗性，V-P试验，M-R试验，接触酶反应，吲哚反应，明胶液化，淀粉水解，硝酸盐还原，对氧需求（厌氧生长），柠檬酸盐利用，酪素水解，尿素利用等。常见的稀释方法：培养皿稀释法：5-6个无菌培养皿，分别滴一滴无菌水或生理盐水，接种环蘸取菌悬液与第一培养皿无菌水混合，在与第二培养皿无菌水混合，依次第三四五六，在各培养皿注入45-50℃培养基12-15mL混匀，倒置培养，在四五六得到单菌落。平板稀释法：取平板4-5个（干燥无冷凝水），在第一平板滴一小滴稀释菌悬液，无菌涂棒涂布，然后用此涂棒在另一平板涂布至4-5。倒置培养，在四五六得到单菌落。试管稀释法（常用法）♀芽孢杆菌一般生理生化试验项目：试验项目12标准菌（枯草芽孢杆菌）革兰氏染色+++糖发酵试验氧需求（厌氧生长）+++葡萄糖+++（产酸不产气）酪蛋白水解+++果糖+++淀粉水解+++蔗糖+++（产酸不产气）明胶水解+++麦芽糖+++硝酸盐还原+++乳糖+++柠檬酸盐或丙酸盐试验+++木糖+++动力试验+++甘露醇或山梨醇+++石蕊牛奶还原+++渗透压试验V-P试验+++无盐胨水+++M-R试验---7℅氯化钠+++PH5.7+++10℅氯化钠+++接触酶---尿素利用---3.种子培养3.1.培养基3.1.1蛋白胨10g/L酵母膏5g/LNaCl0.5g/L葡萄糖2g/LK2HPO41g/LMnSO40.5g/LFeSO40.02g/L(NH4)2SO40.1g/LPH7.2—7.43.1.2蛋白胨10g/L酵母膏5g/L葡萄糖30g/LK2HPO44.5g/L(NH4)2SO42.5g/LCaCO32g/LPH7.0—7.23.1.3蛋白胨5g/L酵母膏1g/L牛肉膏3g/L葡萄糖5g/LMgSO40.5g/L5MnSO40.005g/LPH7.0—7.23.1.4淀粉10-30g/L酵母膏5-10g/L蛋白胨10g/L牛肉膏5g/L3.2.种子培养3.2.1液